125Ⅰ粒子对人结肠腺癌裸鼠皮下移植瘤的敏感性研究

杨 嵘 陈 亿 罗开元

结肠癌发病率近年来有逐年上升的趋势，已受到了医学界同行的极大关注。尽管外科技术有了很大的改进，但术后复发及远处转移仍然是结肠癌患者的主要死亡原因之一。125Ⅰ粒子组织间植入内放射治疗结肠癌的应用在我国有十年左右的历史，临床疗效较好[1]。但是尚缺乏有说服力的基础实验成果为支撑。我们为探讨125Ⅰ粒子对低分化结肠腺癌的治疗疗效及其作用机制，建立了荷瘤裸鼠皮下移植性低分化结肠腺癌模型进行实验研究。

1 材料与方法

1.1 材料

雄性BALB/c-nu裸小鼠48只，SPF级，4～6周龄，体重17～18 g，购于中国医学科学院肿瘤研究所。HCT-116人低分化结肠腺癌细胞株引自美国ATCC，由中国医学科学院肿瘤研究所提供。0.4mCi125Ⅰ 粒子及空白粒子购于上海欣科医药有限公司。ABI prism 7300荧光定量PCR仪为美国应用生物系统公司产品，总RNA抽提试剂盒及逆转录试剂盒为美国Invitrogen公司产品，荧光定量RT-PCR反应体系为Invitrogen公司和Sigma产品，HIF-1α及GAPDH引物采用文献报道序列并由上海生工生物技术公司合成。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的制备 待HCT-116癌细胞贴壁生长后，取对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化，离心后用生理盐水吹打成细胞悬液，在无菌实验条件下，将癌细胞悬液按每只0.2 ml(1×107个细胞)接种于右前肢腋窝皮下，注射局部出现明显皮丘，4 d后出现结节，每隔3天测量肿瘤体积大小，以肿瘤直径5 mm为成瘤。当瘤体长径为6～8 mm时，随机分成对照组及125Ⅰ粒子治疗组。125Ⅰ粒子治疗组使用18 G穿刺针在距肿瘤边缘1 cm处穿破皮肤，皮下潜行进入肿瘤组织，进针约12 mm，退出针芯。将一颗0.4 mCi125Ⅰ 粒子置入穿刺针，用圆头针芯将125Ⅰ粒子轻轻推入肿瘤组织内。对照组植入一粒空白粒子(0 mCi)，与125Ⅰ粒子治疗组做对比。

1.2.2 绘制肿瘤生长曲线图 每3d使用游标卡尺测量实验组及对照组肿瘤长径(a)及宽径(b)，计算肿瘤体积。肿瘤体积=a×b2/2，并绘制肿瘤生长曲线图。

1.2.3 计算肿瘤抑瘤率 每7、14、21、28天各处死一批治疗组及对照组裸鼠，电子天平秤取瘤重，取平均值，计算抑瘤率。肿瘤抑制率(100%)=(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。

1.2.4 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)测定肿瘤组织中HIF-1αmRNA的表达 总RNA抽提及采用RT-PCR 方法，按试剂盒说明书进行操作。HIF- 1α上游引物：5'TCCAAGCCCTCCAAGTAT 3’，下游引物：5 'ATGCTAAATCGGAGGGTA3'，扩增片段为568 bp，将管家基因GAPDH作为内对照，上游引物：5’ACCACAGTCCATGCCATCAC3’，下游引物：5'TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3’，扩增产物为450 bp。荧光定量PCR反应体系20 μL：cDNA模板1 μL。20 × SYBR GREEN I 荧光染料1μL，10 ×PCR buffer 2 μL，50 mmol/L Mg2+0.8μL，Hot-start Taq ase 0.2 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，去离子水补足至20 μL，每个样品均做3个复孔。美国应用生物系统公司的7300型实时定量PCR仪器上进行如下反应：95℃ 10 min，95℃ 15 s，59℃ 20 s,68℃ l min 并收集荧光信号，重复40个循环。PCR结束后采用溶解曲线确定产物特异性,软件分析其Ct值；应用△△Ct进行相对定量，校正公式为Fold induction = 2-△△CT；数据经处理后进行分析比较。

1.2.5 流式细胞仪分析 采用剪碎机械法制备单细胞悬液样品， PBS洗涤，加入70%冷乙醇固定后重新收集细胞，PBS洗去固定液，加入RNA酶反应过夜，在暗室中碘化丙啶(PI)染色混匀15 min后，应用流式细胞仪作流式细胞分析，汞激发波长为488 nm，并应用modfit LT 2.0软件分析细胞周期分布及凋亡率。

1.3 统计学分析

2 结果

所有裸鼠均见肿瘤生长，多成椭圆形，移植成功率为100%：粒子植入前，各组间均瘤体积差异无统计学意义(P>0.05)。各时间段处死裸鼠，取出移植瘤标本。肉眼见肿瘤包膜完整，未向四周浸润。切面瘤体中心是坏死组织，色红。外围肿瘤组织呈白色鱼肉状，中间可见银色金属短棒即是植入的125Ⅰ粒子。移植瘤光镜下HE染色证实为低分化结肠腺癌。

2.1 125Ⅰ粒子治疗组及对照组肿瘤体积测量结果(表1)(图1)

表1 荷瘤裸小鼠皮下移植瘤体积检测结果

125Ⅰ粒子治疗组较对照组肿瘤体积明显缩小，瘤重减轻(P<0.05)。

图1 植入125Ⅰ粒子后肿瘤生长体积变化曲线图

从各组的生长曲线看，对照组的肿瘤生长曲线高抬，粒子植入后第10天可见生长曲线明显上抬，表明肿瘤生长速度显著增快，而治疗组生长曲线一直低平，无明显曲线斜率抬高现象。

2.2 125Ⅰ粒子对HCT-116细胞移植瘤抑瘤率的影响 (表2)

表2 125Ⅰ粒子治疗组与对照组瘤重变化

治疗组荷瘤裸鼠在125Ⅰ粒子植入第3周时，瘤重明显轻于对照组，肿瘤生长受明显抑制，两组瘤重差异有统计学意义，P<0.05。治疗组第四组瘤重为(1.131±0.079)g，对照组第四组瘤重为(2.139±0.094)g，抑瘤率为47.12%。

2.3 125Ⅰ粒子对裸鼠人结肠癌移植瘤HIF-1αmRNA表达的影响

经125Ⅰ粒子连续内照射后，1、2、3、4周治疗组HIF-1αmRNA表达水平均下调(图2、图3)，各治疗组与其对照组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)，治疗组2、3、4周分别与第1周比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。

图2 125Ⅰ粒子作用1、2、3、4周对HCT-116细胞HIF-1αmRNA表达的影响

图3 治疗组和对照组HIF-1αmRNA表达变化趋势图

2.4 流式细胞仪分析细胞周期的再分布

125Ⅰ粒子治疗组细胞周期发生了再分布，见表3。治疗组G2/M期与对照组比较：随着治疗时间的延长呈逐渐增加的趋势，差异有统计学意义(P<0.05)；S期及G0/G1期未发生改变，差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 流式细胞仪检测细胞周期分布结果

3 讨论

125Ⅰ粒子组织间植入治疗结肠癌的临床应用在我国已有10年历史，并已证实该方法是一项有效的治疗手段[2]。但该技术治疗低分化结肠腺癌的基础研究国内外少有报道。

本实验结果提示：125Ⅰ粒子植入到人结肠癌HCT-116裸鼠皮下移植瘤中，可以明显抑制瘤体的生长，延长瘤体倍增时间。经测量瘤重计算得出第28天时肿瘤抑瘤率为47.12%。

肿瘤细胞增殖能力是决定其生长速度的重要因素，低分化结肠腺癌由于其恶性程度较高，增殖能力较强而导致其预后不佳。缺氧诱导因子-1(HIF-1)是缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内的1种转录因子，由α、β 2个亚基组成。HIF-1β为基础表达蛋白，HIF-1α为氧调节蛋白，决定着HIF-1的活性[3]。HIF-lα在常氧状态下极不稳定，而在细胞处于低氧条件时，HIF-α在多种组织细胞中表达水平增高，其稳定性和活性也相应增加。因此，低分化结肠腺癌由于其生长速度较快，超过周围血管的生长速度而导致局部缺氧，进而诱导HIF-1α的过度表达。而HIF-1α能增强其下游靶基因VEGF的表达，活化的HIF-1α与靶基因上的H1F-1α结合位点结合，形成转录起始复合物，从而启动靶基因转录和相应的蛋白产物增加，VEGF表达增加，VEGF进而作用于血管内皮细胞表面的血管内皮生长因子受体VEGFR1和VEGFR2，从而激活了一系列的缺氧转导通路，诱导新血管的生成，促进肿瘤的生长[4]。本实验从基因水平上证实125Ⅰ粒子持续低剂量照射能够诱导肿瘤细胞HIF-1αmRNA表达下调，在一定的时间范围内存在时-效关系。

125Ⅰ粒子持续低剂量照射可以改变HCT-116大肠腺癌细胞周期分布。本实验通过流式细胞仪检测发现随着低剂量持续照射，治疗组细胞周期阻滞于G2/M期，该期对放射线最敏感，限制肿瘤细胞增殖继而促进肿瘤细胞凋亡的发生。

综上所述，125Ⅰ粒子近距离照射治疗低分化结肠腺癌的疗效在本实验中得以肯定。临床术前可通过TPS计划系统计算粒子植入具体位置及剂量大小，术中及术后结合其他方法综合治疗，相信该治疗方法在未来会有更加广阔的应用前景。

[1] 罗开元，李 波，杨 嵘，等.125Ⅰ粒子组织间放射治疗恶性肿瘤的临床应用〔J〕.中华医学杂志，2001，12：754.

[2] 罗开元，邵庆华，杨国凯，等.125Ⅰ粒子植入在低位直肠癌保肛术中的应用〔J〕.中华医学杂志，2005，19：1355.

[3] Gassmann M，Chilov D，Wenger H.Regulation of the hypoxia-inducible factor-1 alpha ARNT is not necessary for hypoxic induction of HIF-1 alpha in the nucleus〔J〕.Adv Exp Med Biol，2000，475：87.

[4] 宋冬梅，张丽莎，王宝山，等.低氧条件下人参皂甙Rg3诱导人喉鳞癌细胞凋亡及对HIF-1α和VEGF表达的影响〔J〕.肿瘤防治研究，2008，35(8)：533.