123I-3H11在荷瘤裸鼠体内的SPECT显像

秦红斌，高惠波，陈大明，杨 志，金小海，白红升，李存福，雷衍庆，尹 卫，*

1.原子高科股份有限公司，北京 102413；2.北京大学 临床肿瘤学院，北京肿瘤医院暨北京肿瘤防治研究所 核医学科，北京 100036

胃癌的死亡率居我国各种癌症之首，患者就诊时多属进展期，对放、化疗不敏感，根治手术效果不理想，迫切需要探索新的诊治方法[1]。应用单克隆抗体可以特异性的识别恶性肿瘤[2]。单克隆抗体3H11与胃癌组织具有高阳性反应率、高选择性及高亲和力的特点[3]。3H11对多种肿瘤组织具有良好的结合特性，并已成功地用于原发肿瘤及转移病灶的临床显像诊断[4-5]。免疫荧光显示，着染部位限于靶细胞的质膜，并得到免疫电镜的证实[6]。其对应抗原为210 kD的蛋白质，基本不含糖[7-8]。近年来，研究者采用131I标记的单克隆抗体3H11对胃癌的导向治疗进行了广泛的动物实验，并取得了一定的研究成果[9-10]。王川等[11]研究了125I-3H11在胃癌放射免疫导向手术的应用价值，在临床取得较满意的效果。张梅颖等[12]采用131I-3H11在荷人胃癌移植瘤中进行γ相机摄片，结果表明，标记物可明显地浓聚在肿瘤部位，可获得较清晰的图像，但标记物大部分仍在血池中，这就可能造成它的肿瘤定位、特别是探测处于高本底部位的病灶不够理想。为了探索更好的显像效果，本工作拟采用核性质优异的123I作为显像核素标记单抗3H11，并对标记物在荷瘤裸鼠体内的生物分布进行观察和SPECT显像，探讨标记物作为胃癌和转移瘤诊断显像剂的可能性，为临床应用提供必要的实验依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装备

FT-603井型γ闪烁探头-FH463A智能定标仪，北京核仪器厂；AR2130型电子天平，感量0.001 g，美国OHAUS公司；单道可调移液器，美国Eppendorf公司；PD-10柱，瑞典GE Healthcare公司；Whatman No.1试纸，英国Whatman公司；Haier BCD-278A/C普通冰箱，市售；单光子发射体断层扫描仪(SPECT)，德国Simens公司；京立LD5-10离心机，北京京立离心机有限公司。

1.2 主要材料与试剂

小鼠单克隆抗体3H11、胃癌BGC823细胞，北京肿瘤研究所惠赠；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，北京博奥森生物技术有限公司；Na123I溶液，原子高科股份有限公司；胃癌荷瘤裸鼠BALB/C(6～8周龄)，SPF级，体重18～20 g，雌性，均于右前腿根部背侧接种2×106个BGC823细胞，8～10 d后肿瘤直径为0.8～1.0 cm，北京大学医学部动物实验中心提供；其余化学试剂均为分析纯，购自北京化学试剂公司。

1.3 3H11标记物亲和常数测定

采用文献[13]报道的优化条件进行3H11的123I标记及标记物的纯化。123I-3H11与BGC823靶细胞的亲和常数采用96孔板法测定。按照每孔3×104个BGC823细胞包被到96孔板，于4 ℃放置过夜，弃去培养液并用200 μL磷酸盐缓冲溶液(PBS，含0.1% BSA，pH=7.4，0.01 mol/L)洗涤3次；每孔加入含5% BSA的PBS 200 μL封闭，37 ℃孵育1 h；将123I-3H11按倍比稀释法配成系列浓度，分别与包被的靶细胞结合，反应平衡后，按上述方法洗涤，洗涤后每孔加入200 μL的2 mol/L NaOH溶液，37 ℃下消化细胞20 min；收集每孔的细胞消化液，并且使用PBS洗3次，合并至消化液中；在γ计数器上测定每管试样为总结合(TB)，并测量标准样的放射性计数。非特异性结合(NBS)每孔再加入200 ng(100 μL)抗体3H11,置于37 ℃孵育1 h后洗涤3次，消化后测γ计数。

1.4 123I-3H11免疫活性测定

取1支放免管加入人血清0.5 mL(5×104个)后再加入1.5 mL PBS记为N管；另取1支放免管加入BGC823细胞1 mL(5×104个)后再加入1 mL PBS记为O管。N管和O管室温放置30 min后离心6 min(3 000 r/min)，离心后取走余液。在离心后的N管和O管中分别加入123I-3H11标记物10 μL(3H11质量浓度0.01 mg/L)，摇匀成悬浮液，37 ℃温育30 min，分别加入2 mL PBS，离心20 min，去上清液，测定放射性计数。再另取1支放免管加入10 μL123I-3H11标记物作为标准液，记为T管，测定总放射性计数。按式(1)计算标记单抗3H11免疫活性。

(1)

1.5 123I标记3H11在胃癌BGC823裸鼠体内评价

1.5.1胃癌裸鼠的生物分布 选用15只BALB/C胃癌裸鼠随机分为3组，每组5只，每只自尾静脉注射0.1 mL活度约1.11 MBq的123I-3H11，并于注射后2、24、48 h眼球取血，颈椎脱臼处死小鼠。取心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、肌肉、骨、甲状腺，称重并测量放射性计数。由于123I半衰期短，为了便于校正放射性衰变，取0.1 mL注射液作标准，与上述生物样品同时测量。最后经衰变校正后计算每克组织百分注射剂量率(%ID/g)和肿瘤组织(T)与正常组织(NT)摄取放射性比(T/NT)。

1.5.2荷瘤裸鼠的SPECT显像 随机取3只荷人胃癌的BALB/C裸鼠(裸鼠封闭甲状腺)于尾静脉分别注射约7.4 MBq123I-3H11并于注射后2、24 h行SPECT显像。显像条件为：低能、高分辨、平行孔准直仪，128×128像素，每只小鼠采集50 000～150 000的放射性计数。

2 结果与讨论

2.1 3H11标记物亲和常数测定结果

123I-3H11与BGC823靶细胞结合的饱和曲线(Prism 5.0软件作图)结果示于图1。对于BGC823靶细胞而言，有其固有的亲和力，当123I-3H11的浓度从零开始增加时，复合物123I-3H11-BGC823的量先快速上升，后逐渐变慢，表明其亲和力高(一般上升越快，亲和力越高)，当标记物的浓度达278.1 pmol/L时，靶细胞绝大部分被饱和，通过Prism 5.0软件计算Kd=6.255×10-9mol/L，说明标记物具有特异性、高亲和力。

图1 BGC823细胞与123I-3H11放射性配基结合分析饱和曲线Fig.1 Saturation binding of 123I-3H11 to BGC823 cells●——TB，◆——SB，▲——NSB

2.2 123I-3H11免疫活性测定结果

在定标仪上测定N管、O管和T管的10 s放射性计数，结果分别为291、3 282、4 349。

按式(1)计算得到标记物的免疫活性为68.8%，标记后单抗免疫活性有一定的损伤。

2.3 123I标记3H11在荷人胃癌BGC823裸鼠的体内评价结果

2.3.1荷瘤裸鼠的生物分布结果123I -3H11在荷人胃癌裸鼠体内的生物分布示于图2。从图2可以看出，标记物进入动物体内后，从血液迅速清除，注射标记物2 h后放射性摄取(Dinj)为(10.35±1.79) %ID/g，24 h后回落到(3.81±0.81) %ID/g；肝对123I-3H11的放射性摄取2 h时高达(8.02±2.52) %ID/g；肾对123I-3H11摄取2 h时高达(6.72±1.16) %ID/g，标记物可能从肝、肾代谢；123I为亲甲状腺核素，当在体内脱落后沉积于甲状腺中，本实验的数据显示，随着时间延长甲状腺中的放射性有增高趋势，并且较其它组织中有明显的偏高，说明了123I-3H11体内有脱碘现象；标记物进入靶肿瘤较快，从注射后2 h的(4.35±1.45) %ID/g增至24 h的(11.06±1.86) %ID/g，有利于尽早开始SPECT显像；肿瘤部位放射性浓度维持了一个较高的水平，而且随时间延长略有升高，由此表明，单克隆抗体3H11的123I标记物具有一定的肿瘤特异性。123I-3H11在荷胃癌裸鼠体内的生物分布T/NT比值列于表1，从表1结果可以分析出，标记物特异性地浓集于肿瘤，而其他组织的放射性摄取较少，即T/NT的放射性活度比值高，注射后24 h肿瘤与血、肠、肌肉比分别为2.90±0.06、17.01±0.26、15.58±0.82；标记物从肿瘤清除较慢，保证了显像时间充足；注射标记物24 h后肿瘤与肝、肺、肠、胃、骨等的T/NT达到较大比值，因此可以考虑药物注射后24 h为较佳显像时间。

图2 123I-3H11在荷胃癌裸鼠体内生物分布柱状图Fig.2 Biodisribution of 123I-3H11 in the bearing mice1——血(Blood)，2——肿瘤(Tumor)，3——甲状腺(Hypothyroid),4——肝(Liver)，5——肾(Kidney)，6——肺(Lung)，7——胃(Stomach)，8——脾(Spleen)，9——心(Heart)，10——肠(Intestine)，11——骨(Bone)，12——肌肉(Muscle)

2.3.2荷瘤裸鼠的SPECT显像结果 荷瘤裸鼠分别注射123I-3H11后2、24 h行SPECT显像，从各时刻显像图看，血中放射性本底早期较高，标记物主要存在于血液中，肝、肾等器官血运丰富，放射性分布较多而显影明显，肿瘤部位积聚少量显像剂，肿瘤轮廓较清晰(图3(a))；随着血液中标记物的清除，心脏、肾、肺和胃等器官放射性摄取整体也随血液清除的增多而降低，肿瘤部位浓聚显像剂增多，肿瘤显像更清晰(图3(b))。荷瘤裸鼠的SPECT显像结果与裸鼠体内生物学分布结果基本一致。

表1 123I-3H11在荷胃癌裸鼠体内的生物分布T/NT比值Table 1 T/NT ratios of 123I-3H11 in tumor-bearing mice

注(Note)：n=5

图3 2 h(a)和24 h(b)时123I-3H11在荷瘤裸鼠体内的SPECT显像图Fig.3 SPECT imaging of 123I-3H11 in tumor-bearing mice at 2 h(a) and 24 h(b) post intravenous injection

3 结 论

123I标记的胃癌单克隆抗体3H11具有很好的生物活性，与BGC823靶细胞有较高亲和力；标记物有较好的裸鼠体内生物学行为，靶组织摄取较高，其它组织器官的非特异摄取较低；123I-3H11注射后24 h获得清晰的肿瘤显像。123I-3H11放射免疫显像图像清晰，是一种非常有潜力的放射性显像药物，引入临床将有待于进一步研究。

[1] 董志伟,魏淑敏,张梅颖,等.胃癌单克隆抗体3H11的应用[J].中国肿瘤生物治疗杂志，1995,2(2):84-87.

[2] Bruskin A, Sivaev I, Persson M, et al. Radiobromi-nation of Monoclonal Antibody Using Potassium [76Br] (4 Isothiocyanatobenzyl-Ammonio)-Bromo-Decahydro-Closo-Dodecaborate (Bromo-DABI)[J]. Nucl Med Biol, 2004, 31: 205-211.

[3] 梁亚云,王耐勤,李 农,等.单克隆抗体与丝裂霉素交联物对人胃癌细胞的选择性杀伤作用[J].药学学报,1989,24(11):801-806.

[4] 寿成超,李彩凤,孟 麟,等.抗胃癌单链抗体的构建、表达及活性测定[J].中华核医学杂志，1997,77:434-438.

[5] Xu G W, Zhang M Y, Liu B G, et al. Radioimmunoguided Surgery in Gastric Cancer Using131I Labeled Monoclonal Antibody 3H11[J]. Semin Surg Oncol, 1994, 10: 88.

[6] 魏淑敏，郭 琪，刘晓兰,等.胃癌单克隆抗体的免疫电镜定位研究[J].中华肿瘤杂志，1991,13(2):87.

[7] 李振甫,万文徽,张 宏,等.抗胃癌单克隆抗体3H11对应抗原的纯化及鉴定[J].生物化学杂志，1993,9(3):260.

[8] Chen Donghai, Shou Chengchao. Molecular Cloning of a Tumor-Associated Antigen Recognized by Mono-clonal Antibody 3H11[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 280: 99-103.

[9] 吕大鹏,徐光炜,张梅颖,等.131I-3H11腹腔给药对Wistar大鼠肠道吻合口愈合影响的实验研究[J].实用肿瘤杂志,2003,18:299-301.

[10] 吕大鹏,徐光炜,张梅颖,等.131I-3H11防治胃癌肝转移瘤形成的实验研究[J].肿瘤防治研究,2002,29:291-300.

[11] 王 川,王 怡,苏向前,等.125I标记单克隆抗体3H11在胃癌放射免疫导向手术中的应用的初步研究[J].外科理论与实践,2000,5:163-166.

[12] 张梅颖,朱家瑞,许小宝,等.131I标记胃癌单克隆抗体3G9及F(ab/)2片段和3H11在荷人胃癌移植瘤裸鼠体内分布的研究[J].中华核医学杂志,1989,9:154-157.

[13] 秦红斌,尹 卫,高惠波,等.3H11的123I标记及其生物分布[J].同位素,2010,23(2):76-80.