嗜酸乳杆菌对球形幽门螺杆菌的细胞黏附和增殖作用的影响＊

吴小茜,佘菲菲,李 能,郑秀芬,陈月秀

嗜酸乳杆菌对球形幽门螺杆菌的细胞黏附和增殖作用的影响＊

吴小茜,佘菲菲,李 能,郑秀芬,陈月秀

目的 研究球形幽门螺杆菌(H p)对AGS细胞的黏附和增殖作用及热灭活状态和活菌状态嗜酸乳杆菌对其产生的影响。方法制备AGS细胞爬片,按球形 H p对照组、球形 H p与活/灭活嗜酸乳杆菌实验组加入细菌,电镜、革兰染色后光镜观察 H p对AGS细胞黏附指数,同时用荧光抗体染色法评价黏附于AGS细胞的 H p密度。运用CCK-8比色法检测球形 H p对AGS细胞的增殖影响及比较加入嗜酸乳杆菌产生的变化。结果实验组与对照组比较,球形 H p对细胞的黏附指数及黏附密度均明显下降(P<0.05)。低浓度的球形 H p促进细胞增殖,高浓度的球形 H p抑制细胞增殖。两种不同状态的嗜酸乳杆菌均能降低 H p对AGS细胞增殖的影响。结论球形 H p对AGS细胞具有黏附能力并随浓度不同对其产生不同增殖影响,嗜酸乳杆菌能降低其作用。

嗜酸乳杆菌;球形幽门螺杆菌;黏附;增殖

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H p)存在二种形态,螺旋野生形和球形变异形。有证据支持球形 H p在细菌的传播、致病甚至致癌潜能上起作用。嗜酸乳杆菌作为益生菌,其抗炎、抗肿瘤的作用日益得到重视。本实验拟从研究球形 H p对胃上皮细胞的黏附和增殖作用及嗜酸乳杆菌对其产生的影响入手,求证球形 H p在 H p感染的病因学与流行病学中的作用并初步探讨将嗜酸乳杆菌推广作为H p感染预防、治疗的常规辅助手段的可行性。

1 材料与方法

1.1 菌株与培养 嗜酸乳杆菌标准株6075购自CICC(中国工业微生物菌种保藏中心)。H p国际标准株NCTC11637为本系保存。

1.1.1 嗜酸乳杆菌的制备 采用MRS液体培养基在普通气体环境下37℃静止培养36 h,收集菌液分为活菌和灭活二组,灭活组经75℃水浴灭活30 min。以无血清无双抗的 F12高糖培养液重悬,调整细菌浓度为2×108CFU/m L。

1.1.2 球形 H p的制备 将 H p传代后再培养2d,用布氏肉汤(含10%小牛血清)洗下细菌,制成菌悬液。加入灭滴灵(终浓度16μg/m L),37℃微氧环境培养,直至 H p全部转为球形(约48h)。经显微镜下观察及再培养无菌生长,确定为 H p已完全球变。以无血清无双抗的F12高糖培养液重悬,调整细菌浓度为2×108CFU/m L。

1.2 细胞培养 人胃上皮腺癌细胞系AGS细胞由本系保存,培养液为含10%胎牛血清的F12高糖培养液(含10%胎牛血清,青霉素200 IU/mL,链霉素50μg/m L)。置于体积分数为0.05的CO2培养箱中培养,隔天传代,实验所用细胞均处于对数生长期。

1.3 细胞爬片制备 于6孔板内置盖玻片,每孔接种1×105个/m L密度的A GS细胞液2 m L,过夜培养,制成爬片。

1.4 球形 H p对AGS细胞的黏附作用及嗜酸乳杆菌对其影响研究。

1.4.1 电镜、光镜观察分析球形 H p对A GS细胞的黏附情况及嗜酸乳杆菌对其产生的影响 将球形H p(对照组)、球形 H p加活/灭活嗜酸乳杆菌(实验组)分别加入6孔培养板中,在37℃,体积分数为0.05的CO2环境中与AGS细胞作用2 h。2 m L菌液/孔,调整每孔中嗜酸乳杆菌及 H p菌量分别达到108个。PBS洗3次,革兰染色后油镜下观察并随机计数50个细胞球形 H p的黏附数量。推算出每个上皮细胞的粘附指数:粘附指数=粘附球形 H p数/细胞数。

同样处理的细胞爬片,制成电镜样本在飞利浦EM 208型透射电镜下观察、摄影〔1〕。

1.4.2 荧光抗体染色法定性及半定量评价嗜酸乳杆菌的加入对球形 H p黏附细胞的密度影响 将制备的细胞爬片分组:球形 H p组、空白对照组、球形H p加活/灭活嗜酸乳杆菌组。在37℃,体积分数为0.05的CO2环境中与AGS细胞作用2 h。2 m L液体/孔,除空白对照孔加2 mL无血清 F12高糖培养液外,调整其余各组每孔中嗜酸乳杆菌及 H p菌量分别达到108个。PBS洗3次,兔抗11637多克隆抗体(教研室自备)37℃作用30 min,PBS洗3次,用FITC标记的羊抗兔抗体(购自武汉博士德生物工程有限公司)作用30 min,经洗涤封片后于荧光显微镜下观察并拍照。使用 ImagePro Plus4.5图像分析系统测定每张荧光照片的总积分光密度值(IOD)。

1.5 CCK-8比色法检测球形 H p对AGS细胞的增殖影响及加入嗜酸乳杆菌后产生的变化 将1×105/m L的AGS细胞接种于96孔细胞板,100μL/孔,24h后换液,加无血清的F12高糖培养液继续培养24h,使细胞同步化。待细胞生长至对数生长期,以无血清的F12高糖培养液对新鲜制备菌悬液做倍比稀释,加入细胞板。实验分球形 H p组(100μL/孔),球形 H p(50μL/孔)加活/灭活嗜酸乳杆菌(50μL/孔)组。调整每个实验组球形 H p、活/灭活嗜酸乳杆菌的细菌与细胞比MO I(Multiplicity of infection)初始为2 000∶1。设无细菌无血清细胞培养液处理的细胞组为对照组。每个工作浓度设3个复孔,共培养1d。用 PBS洗涤3遍,每孔加入无血清维持液 100μL,CCK-8试剂10μL。体积分数为0.05 CO2环境中继续培养3h。室温避光摇床上充分震荡10min。选择450nm波长,在酶标仪上测定各孔吸光度(OD)值。增殖率=(实验组OD-对照组OD)/对照组OD×100%。

1.6 统计学分析 每次实验均重复3次。采用SPSS 10.0统计软件,统计分析的数值以均数±标准差表示,比较分析采用成组 t检验和单因素方差分析(one-w ay ANOVA)。

2 结 果

2.1 不同状态嗜酸乳杆菌对球形 H p细胞黏附指数的影响

2.1.1 不同状态嗜酸乳杆菌对球形 H p黏附AGS细胞的影响 电镜及革兰染色后油镜下均可见:球形 H p对AGS细胞仍具有较强黏附活性。电镜下可见AGS细胞的形态结构未发生明显变化,少数球形 H p可侵入细胞(见图1),黏附指数为51.46±25.33。存活/灭活嗜酸乳杆菌加球形 H p实验组(见图2)黏附指数分别为27.91±11.21/33.27±13.54,较之球形 H p组明显下降 P<0.05。灭活状态的嗜酸乳杆菌对球形 H p黏附指数的影响与活菌比P>0.05。

2.1.2 荧光抗体染色法定性及半定量评价嗜酸乳杆菌的加入对不同形态 H p黏附细胞的密度影响荧光显微镜下可见,球形 H p能较高密度的黏附于AGS细胞上(见图 3.1),IOD值:12.4±3.18。存活/灭活嗜酸乳杆菌加球形 H p实验组中,其 H p的黏附密度有明显降低(见图3.2),IOD值分别为3.1±0.91/2.8±0.76,与球形 H p组比较,P<0.05。灭活状态的嗜酸乳杆菌的加入对球形 H p黏附细胞的密度影响与活菌比无明显差异 P>0.05。

2.2 CCK-8比色法检测嗜酸乳杆菌的加入使球形H p对AGS细胞增殖影响产生的变化。

2.2.1 球形 Hp对AGS细胞增殖的影响(表1) 低感染密度状态下(MOI≤32∶1),实验组OD值高于对照组(P<0.05),显示此时球形 Hp具有促进AGS细胞增殖的作用,且其促增殖作用随着球形 H p浓度的降低而增强。而高感染密度状态下(MO I≥250∶1),实验组OD值低于对照组OD值(P<0.05),表明此时球形 Hp具有抑制AGS细胞增殖的作用,且随着感染密度的增加,抑制作用逐渐增强。

2.2.2 嗜酸乳杆菌的加入使球形 H p对A GS细胞增殖影响产生的变化(表2) 与球形 H p实验组相比,活性和灭活状态的嗜酸乳杆菌的加入均能使同一MO I的球形 H p对AGS细胞的促增殖或抑制增殖的作用明显减弱(P<0.05)。同一MO I时,加入两种状态嗜酸乳杆菌的球形 H p实验组间的OD值无明显差异(P>0.05)。

表2 CCK-8比色法检测嗜酸乳杆菌的加入使球形 H p对AGS细胞增殖影响产生的变化Table 2 Detected the change of effect of coccoid H p on the growth of AGS cells by adding the inactivator or living Lactobacillus acidophilus by CCK-8 assay

图1 电镜下球形 Hp组↑球形 H pFig.1 Transm ission electron m icrograph of AGScellsadhered by coccoid H p(×12500)

图2 光镜下球形 Hp竞争实验组⇧嗜酸乳杆菌Fig.2 The effect on adherence of coccoid H p to AGScells by Lactobacillus acidophilus under m icroscope(×1000)

图3 嗜酸乳杆菌对球形 Hp黏附细胞的密度影响(×400)图3.1 球形 H p对照组;图3.2球形 H p+嗜酸乳杆菌组Fig.3 The effect on the density of the adhered coccoid H p by Lactobacillus acidophilus(×400)

3 讨 论

球形 H p被倾向于认为是 H p的休眠方式,毒力和活性减弱,在条件适宜时转化为螺旋形而致病。故而其在 H p感染的致病与流行环节中的作用始终未得到足够的重视。然而流行病学调查显示:饮用水与 H p感染关系密切,支持 H p经水传播的观点〔2-3〕,而 H p在无营养的水中3～4 d后已全部转变为球形菌〔4〕。有研究显示抗生素治疗后,球形H p在胃中的潜伏〔5〕,是其成为消化性疾病复发的重要原因之一。我们的实验中,光镜和电镜和荧光镜均显示:球形 H p具有较强的胃上皮细胞黏附能力。牢固黏附以对抗胃肠道的蠕动是 H p感染的第一步,阻断外源入侵的球形 H p或治疗后球变的H p的黏附,无疑能够对预防其感染和根除治疗起积极作用。值得注意的的是,虽然传统认为 H p为非侵入性细菌,然而,于东红等〔6〕发现球形 H p可进入癌细胞,本实验组既往的研究也证实其能侵入Hep-2细胞〔7〕。本次实验中,透射电镜下我们观察到少数在细胞内的球形 H p,并拍摄到一个正侵入上皮细胞的球形 H p,证实球形 H p能侵入细胞。而针对螺旋形 H p,目前仅见 Oh JD等〔8〕的研究报告:少数的螺旋形 H p能侵入细胞。球形 H p是否独立于螺旋形 H p具有入侵细胞的侵袭力,胞内寄生的细菌在 H p的感染及免疫上所起的作用值得引起关注和进一步探讨。

嗜酸乳杆菌可在胃内常驻,是安全的微生态制剂,其对 H p抗炎抑制作用已有相关报导,但机制至今未明,且研究也局限于螺旋形 H p。

本研究结果显示:嗜酸乳杆菌加入后,球形 H p对AGS细胞的黏附指数及黏附密度均明显下降。而活菌状态的嗜酸乳杆菌与非活菌状态的嗜酸乳杆菌对黏附指数的影响无明显差异,推测其主要通过表面结构成分发挥拮抗作用,而不是代谢产物。

Hp被列为人类Ⅰ类致癌原。针对螺旋形 H p展开的体内实验一致支持其具有促细胞增殖作用,但体外的研究却结果不一。然而有学者发现,胃癌组织中的 H p通常是以球形菌的形式存在,癌变胃组织中球形 H p的检出率显著高于溃疡病患者〔9〕。提示球形 H p在胃癌的形成中可能比螺旋形 H p起更重要的作用。本研究中显示:体外实验中高浓度的球形 H p抑制AGS细胞的增殖,极低浓度时则能明显的促进AGS细胞的增殖。这与之前我们实验组用M TT法研究球形幽门螺杆菌对SGC-7901细胞增殖的影响的结果一致〔10〕。预示低浓度球形 H p可能通过促进细胞增殖而在 H p的潜在致癌性上发挥作用。其机制正待进一步的分子水平的研究。

本实验,随着热灭活状态和活菌状态嗜酸乳杆菌的加入,可引起其同一浓度下球形 H p抑制细胞增殖或促进细胞增殖效应减小。但两种不同状态的嗜酸乳杆菌抑制作用无显著差异。推测嗜酸乳杆菌对球形 H p对AGS细胞增殖影响主要通过菌体成分诱发。

总之,球形 H p通过其较强的细胞黏附能力和不同浓度时对胃上皮细胞的不同增殖影响而在 H p感染的病因学与流行病学中可能同样起重要的作用,并从拮抗球形 H p作用的角度验证了将嗜酸乳杆菌推广作为 H P感染预防、治疗的常规辅助手段的可行性。

〔1〕金丽,钟秀容,陈莲云,等.鹿石合剂对缺氧缺血脑损伤新生大鼠海马神经元超微结构的影响〔J〕.福建医科大学学报,2008,42(2):96.

〔2〕Baker KH,Hegarty JP.Presence of Helicobacter pylori in drinking water isassociated with clinical infection〔J〕.Scand J Infect Dis,2001,33(10):744-746.

〔3〕Bunn JE,M ac Kay W G,Thomas JE,et al.Detection of Helicobacter pylori DNA in drinking water biofilms:implications for transmission in early life〔J〕.Lett Appl Microbiol,2002,34(6):4540-4544.

〔4〕佘菲菲,朱苹,史碧山,等.水中幽门螺杆菌的球形变异及其致病力〔J〕.中华微生物学和免疫学杂志,2001,21(4):395-396.

〔5〕Axon AT,Moayyedi P.Eradication of Helicobacter pylori:omep razole in combination with antibiotics〔J〕.Scand J Gastroenterol suppl,1996,215:82-89.

〔6〕于东红,王启之,贾继辉,等.癌组织中幽门螺杆菌球形体的超微结构研究〔J〕.中国人兽共患病杂志,2004,20(3):190-192.

〔7〕佘菲菲,苏东辉,朱苹,等.抗生素诱变的球形幽门螺杆菌定居毒力的研究〔J〕.中华消化杂志,1999,19(3).

〔8〕Oh JD,Karam SM,Gordon JI.Intracellular Helicobacter pylori in gastric epithelial p rogenitors〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(14):5186-5191.

〔9〕Chan W Y,Hui PK,Leung KN,et al.Coccoid formsof Helicobacter pylori in the human stomach〔J〕.Am J Clin Pathol,1994,102(4):503-507.

〔10〕陈豪,张静,佘菲菲,等.球形幽门螺杆菌对 SGC-7901细胞增殖的影响〔J〕.中国微生态学杂志,2004,16(2):78-79.

The effect on cell adhesion and proliferation of coccoid Helicobacter pylori by Lactobacillus acidophilus

WU Xiao-qian,SHE Fei-fei,L INeng,ZHENG Xiu-fen,CHEN Yue-xiu
(Department of Pathogen Biology,Fujian Medical University,Fuzhou 350004,China)

The aim was to investigate the adhesion and proliferation of coccoid Helicobacter pylori(H p)to the AGS cell and the effect of adding inactivated or living Lactobacillus acidophilus.The AGS cell-seeded coverslips were prepared to react with the control group(coccoid H p alone)and the experimental group(coccoid H p combined with inactivated o r living Lactobacillus acidophilus).The changeon adherence index of H p to AGS cells wasob served under transmission electron microscope and microscope after Gram stain.The density of the adhered coccoid H p was evaluated under the fluorescence microscope by using FITC-conjugated antibody.The effect of coccoid H p on the grow th of AGS cells was detected by CCK-8 assay and the changes induced by the inactivated o r living Lactobacillus acido philus were compared.Compared with those in the control group,the adherence index and density of the experimental group were significantly lower(P<0.05).High concentration of coccoid H p could significantly inhibit the proliferation of the AGS cells(P<0.05)and low concentration of coccoid H p could significantly promote the proliferation of the cells(P<0.05).Both inactivated and living Lacto bacillus acidophilus could reduce the effect of coccoid H p on the proliferation of AGScells.Coccoid H p has fairly strong adherence ability to AGScellsand different concentrations of coccoid H p could affect the proliferation of AGS cells.However,both the inactivated and living Lactobacillus acidophilus could reduce these effects.

Lactobacillus acidophilus;coccoid Helicobacter pylori;adherence;proliferation

R378.9

A

1002-2694(2010)11-1021-04

＊福建省教育厅基金(JA 07082)

吴小茜,Email:w xq20044@hotmail.com

福建医科大学病原生物学系,福州 350004

2010-05-20;

2010-09-26