中国6省莱姆病螺旋体主要宿主动物鼠的初步调查

侯学霞,耿 震,郝 琴,张 洋,万康林

中国6省莱姆病螺旋体主要宿主动物鼠的初步调查

侯学霞,耿 震,郝 琴,张 洋,万康林

目的 了解中国吉林、山西、甘肃、青海、贵州、湖南6省林区莱姆病螺旋体宿主动物鼠的感染情况。方法在每个省各选取两个采样点进行捕鼠,采用病原分离培养和巢式PCR方法对野鼠的脾脏、肾脏和膀胱进行了病原学检测。并通过基因测序方法确定基因型。结果从贵州黑线姬鼠中分离到了2株莱姆病螺旋体;从5省(贵州未检测到)野鼠的脾脏和/或肾脏中检查到了莱姆病螺旋体的特异片段,其中青海黄南(28.85%)和湖南石门(19.6%)两地标本的PCR阳性率较高,各地区阳性率的差异有统计学意义。通过序列同源性分析确定吉林、青海、甘肃和山西的基因型均为Borrelia garinii。湖南的基因型为Borrelia valaisiana。结论本次调查表明各地宿主动物鼠的感染状况不同,各地应根据具体情况进一步扩大调查以明确当地的主要宿主动物种类及携带病原体情况。

莱姆病螺旋体;宿主动物;病原学检测

莱姆病(Lyme disease)是一种人兽共患病,其病原体为伯氏疏螺旋体。蜱为其主要的传播媒介,鼠类和一些小型哺乳动物可作为宿主动物,在不同国家和地区其宿主动物也存在一定的差别〔1-2〕。美国已从多种动物和和鸟类分离到该病原体,并认为白脚鼠和白尾鹿是最重要的动物宿主。我国已从白腹鼠、褐家鼠、黑线姬鼠和华南兔等动物中分离得到莱姆病螺旋体〔3-4〕。为了解我国莱姆病螺旋体主要宿主动物鼠的感染状况,我们于2006年对中国吉林、山西、甘肃、青海、贵州和湖南6省进行了鼠带菌率的调查。

1 材料和方法

1.1 调查点选择 每省选2个调查点,吉林长白、通化;山西垣曲、交城;甘肃迭部、民乐;青海互助、黄南;贵州道真、务川;湖南浏阳、石门,共12个调查点。

1.2 野鼠调查

1.2.1 病原体分离培养 在野外采用笼捕法抓活鼠,经无菌操作取活鼠或死亡不超过16h鼠的脾脏和肾脏(接近髓质的皮质),取绿豆大小的组织,接种于BSKⅡ培养基,33℃培养,7d后检查,每周检查1～2次,连续3个月培养为阴性弃去。

1.2.2 PCR检测 鼠标本DNA模板的制备

①取3～5mm见方(约50mg)的脾或肾组织在研磨器中加入500μL的 TRIzol,研磨,将悬液 15 000r/min,离心15min;

②弃上清,加入150μL无水乙醇,反复混匀后室温静置2min,15 000r/min,离心5min;

③弃上清,加入0.1μL/l柠檬酸钠和70%乙醇(柠檬酸钠∶乙醇 =1∶9)500μL,反复混匀,室温静置30min,15 000r/min,离心5min;

④弃上清,加入75%乙醇500μL,反复混匀,室温静置15min,15 000r/min,离心5min;

⑤弃上清,将DNA室温干燥15min;

⑥加入 TE(p H=8.0)液50μL,混匀;

⑦置-20℃储存备用。

1.2.3 宿主动物鼠标本中莱姆病螺旋体的检测 采用巢式PCR方法检测带菌情况。引物根据参考文献〔5〕,以伯氏疏螺旋体5S-23SrRNA间隔区两侧基因高度保守区合成内外引物两对。

第一轮上游:5′-CGACCTTCTTCGCCTTAAAGC-3′

第一轮下游:5′-TAAGCTGACTAATACTAATTACCC -3′

第二轮上游:5′-TCCTAGGCATTCACCATA-3′

第二轮下游:5′-GAGTTCGCGGGAGA-3′

反应条件见表1。

表1 PCR检测反应条件Table 1 PCR conditionsof reaction

1.3 测序及序列分析 将PCR产物送上海生物工程有限公司测序,并用MegAlign软件进行聚类分析。

1.4 菌株和主要试剂 标准菌株B31、BSKⅡ培养基由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供;TRIzol购于上海生物工程有限公司;100bpDNALadder、TaqDNA 聚合酶、dNTP、琼脂糖、购于华美生物公司。

2 结 果

2.1 标本收集 2006年在我国6省山林地区共收集到野鼠463只,具体见表2。

2.2 病原检测结果

2.2.1 对6省共400余只野鼠脾脏、肾脏和膀胱进行了病原分离培养,仅从贵州黑线姬鼠标本中分离到2株螺旋体,经单克隆抗体鉴定均为莱姆病螺旋体。

2.2.2 Nested-PCR检测结果(见表2) 其中青海黄南28.85%、湖南石门19.6%的带菌率较高,而吉林长白6.90%、甘肃民乐6.67%的带菌率较低,差异有统计学意义(χ2=20.60,P<0.05)。

表2 中国六省不同地区鼠标本PCR检测结果Table 2 PCR results for rats in different regionsof the six provinces

2.2.3 测序结果 我们从每个省鼠的PCR阳性产物中随机挑选一份送公司测序,序列用MegAlign软件进行聚类分析。结果显示,湖南的序列 HNm1.seq与Borrelia valaisiana基因型的标准菌株UK的序列较为接近;而吉林、青海、甘肃和山西的序列与Borrelia garinii基因型的标准菌株20047的序列较为接近。

图1 中国六省鼠标本PCR阳性产物序列聚类图Fig.1 The dendrogram of the sequence of th PCR positioe produets of mouse in six provinces of China

3 讨 论

本次调查显示:通过巢式PCR方法从五省不同地区检测到莱姆病螺旋体的特异片段,青海黄南(28.85%)和湖南石门(19.6%)两地山林地区鼠的带菌率为最高,各地区宿主动物鼠之间带菌率的差异有统计学意义(χ2=20.60,P<0.05),原因可能为这些地区的地理环境,气候条件等影响鼠的种类,而莱姆病带菌率主要受鼠种差异的影响,不同鼠种携带的莱姆病螺旋体能力不同〔6-8〕。并经比对显示,湖南存在Borrelia valaisiana基因型,这在我国是首次报道。吉林、青海、甘肃和山西存在Borrelia garinii基因型,这进一步提示了野鼠为莱姆病螺旋体的重要储存宿主〔9-10〕。同时也证明吉林、贵州、甘肃的莱姆病基因型同已报道的莱姆病主要基因型相符〔11-12〕。其中山西、青海首次被列为莱姆病宿主动物调查地区,并且第一次在山西省发现了Borrelia garinii基因型,在湖南省发现了Borrelia valaisiana基因型,具有重要的流行病学和临床意义,这项调查为当地莱姆病疫源地的发现和研究提供了重要证据。进一步的研究将填补我国山西和湖南两省莱姆病新基因型的流行病学特征及其引发各种临床症状的进展和临床转归关系方面认识的空白,为进行有效防治提供重要的科学依据。但由于本研究从六省中每省只选取了两个调查点采样,这样不能代表全省的情况,建议在每个省内至少选取4～5个调查点,因此尚需开展进一步调查研究,每一个调查点应该尽可能的从数量上多采集一些标本,样本量过少容易发生统计学偏倚。贵州的鼠标本未能检测到阳性,原因可能是样本量过少,提示在今后的调查中应该增加样本量以减少偏倚。

与病原体分离培养相比,Nested-PCR技术具有操作简便、迅速的特点,因此越来越得到广泛应用。据文献报道〔13〕,对现场捕获的动物组织直接进行PCR扩增,其敏感性高于病原体分离培养,不会存在螺旋体分离培养过程菌株的选择作用,使结果更加接近于螺旋体在自然界中的原貌,而且通过核苷酸序列分析,还能够获得有关不同菌株之间差异的丰富信息,可以为进一步深层次的研究提供线索。Nested-PCR技术的灵敏度高,假阴性少,是其他常规检测莱姆病螺旋体感染方法(如:IFA,EL ISA,WB)所无法比拟的〔14〕。但是Nested-PCR最大的缺点是容易污染,由于DNA扩增效率高,微量的污染即可变成阳性。只要操作者能创造一个超净的环境,认真仔细操作,Nested-PCR扩增过程中的污染问题是可以避免的。

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Rats,the primary reservoir hosts of Borrelia burgdor feri,in six representative provinces,China

HOU Xue-xia,GENG Zhen,HAO Qin,ZHANG Yang,WAN Kang-lin
(Institute of Communicable Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention/State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control,Beijing 102206,China)

The objective of this study was to understand the status of rats,the reservoir hosts of Borrelia burgdorferi,in the six rep resentative provinces in China including Jilin,Shanxi,Gansu,Qinghai,Guizhou and Hunan.The rats were catched in two different areas in each p rovince and the pathogens were isolated and cultured.Nested-PCR was used to test Borrelia burgdorferi in spleen,kidney and bladder of rats.The sequence analysis was used to identify the genotype.Results indicated that two strains of Borrelia burgdorferi wereobtained from apodemus in Guizhou;the specific fragments of Borrelia burgdorferi were obtained in spleen and kidney of rats from all representative provinces in China expect Guizhou;the PCR positive ratewas higher in Huangnan(28.85%)and Shimen(19.6%);therewere statistical differences in theareas.The sequenceanalysis show s that the genotype in Jilin,Qinghai,Gansu and Shanxibelongs to Borrelia garinii,and in Hunan belongs to Borrelia valaisiana.The results indicated that there were different infection rate in rats infected in the six provinces,thus further investigation should conduct for the primary reservoir hosts and for the pathogens carrying situation in different areas of China.

Lyme disease spirochetes;reservoir hosts

R377

A

1002-2694(2010)11-1034-03

万康林,Email:klwan1217@163.com

中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 传染病预防控制国家重点实验室,北京 102206

2010-05-25;

2010-09-16