抗氧化剂对急性肺损伤大鼠细胞因子的影响研究*

刘 薇 张 慧 常 诚 林书祥 赵津生 郑 捷 黄敬孚

抗氧化剂对急性肺损伤大鼠细胞因子的影响研究*

刘 薇 张 慧△常 诚 林书祥 赵津生 郑 捷 黄敬孚

目的：探讨急性肺损伤（ALI）的发病机制及抗氧化剂对ALI大鼠细胞因子的影响。方法：健康、成熟Wistar大鼠60只随机平均分为模型组和治疗组，2组均以大肠杆菌腹腔注射，建立ALI动物模型。治疗组在注射大肠杆菌30 min后，经大鼠尾静脉注射还原型谷胱甘肽。分别于注射大肠杆菌后3、6、12 h测定2组血中IL-8、IL-10的变化。结果：模型组注射大肠杆菌后3 h出现ALI症状，6 h更为明显，12 h口吐粉红色分泌物，解剖后肉眼所见双肺有明显水肿及出血点，氧合指数及肺湿/干重比均达到ALI诊断标准。治疗组3 h无明显变化，6 h呼吸稍促，12 h肺组织仅轻度水肿。在使用还原型谷胱甘肽后，治疗组肺湿/干重比各时段检测值均低于模型组，其中6、12 h差异有统计学意义（P<0.05）；IL-8检测值各时段均低于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05）；IL-10检测值各时段均高于模型组，6、12 h差异有统计学意义（P<0.05）。结论：ALI时存在炎性介质的失控与失衡，应用还原型谷胱甘肽后可有效调控炎性介质，从而降低ALI的发生概率。

呼吸窘迫综合征,成人 疾病模型,动物 谷胱甘肽 白细胞介素8 白细胞介素10 细胞因子类大鼠,Wistar

急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是常见危重症，病死率极高，其基本病理生理改变是肺泡上皮和肺毛细血管内皮通透性增加所致的非心源性肺水肿，在疾病发展过程中有多种细胞因子参与[1]。还原型谷胱甘肽主要存在于细胞胞浆内，对维持细胞的正常代谢，保护细胞膜的完整性具有重要的生化功能作用[2]。本实验通过建立ALI动物模型，检测其在应用抗氧化剂（还原型谷胱甘肽）前后炎性细胞因子白细胞介素（IL）－8、IL－10表达的变化，探讨抗氧化剂对ALI细胞因子的影响效应。

1 材料与方法

1.1材料 （1）实验动物。健康、成熟Wistar大鼠60只，购自天津医科大学动物实验室，雌雄各30只。随机分为2组，模型组30只，雌雄各15只，平均体质量（198.4±12.7）g，平均（4.20±0.13）月龄；治疗组30只，雌雄各15只，平均体质量（196.8±12.1）g，平均（4.19±0.13）月龄。2组平均体质量（t=0.499 6）、月龄（t=0.2）差异均无统计学意义（P>0.05）。（2）仪器与试剂。美国NOVA PHOX全自动血气分析仪，大肠杆菌（O11B4，美国Sigma公司），还原型谷胱甘肽（积华药业有限公司），乌拉坦（武汉银河化工有限公司），福尔马林（江苏永华精细化学品有限公司）。

1.2方法 模型组和治疗组均以大肠杆菌2 mL/kg腹腔注射，以氧合指数[p（O2）/FiO2]≤300 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）、肺湿/干重比、肺组织病理改变为标准，成功建立ALI动物模型[3]。治疗组在注射大肠杆菌30 min后，经大鼠尾静脉注射还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）800 mg/kg。各组内大鼠每10只为一批分别在注射大肠杆菌后3、6、12 h，用乌拉坦麻醉，经腹主动脉取血，即刻送血气分析，其余部分离心保存。大鼠气管插管，用生理盐水做肺灌洗，回收率90%，回收液离心保存，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）方法测定血中IL-8、IL-10的变化。大鼠处死后取右肺下叶组织于10%福尔马林液中固定，左肺称体质量，并自然干后再称体质量，计算肺湿/干重比。

1.3统计学处理 所有数据采用SPSS 13.0软件处理，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用成组t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1一般情况比较 注射大肠杆菌后，模型组大鼠3 h组出现呼吸稍促、寒战、毛发潮湿现象，6 h组上述现象更为明显，12 h组口吐粉红色分泌物，解剖后肉眼可见双肺有明显水肿及出血点，氧合指数及肺湿/干重比均达到ALI诊断标准；治疗组大鼠3 h组无明显变化，6 h组呼吸稍促，12 h组肺组织仅轻度水肿。

2.2肺湿/干重比检测结果 治疗组大鼠肺湿/干重比在3、6、12 h时检测值均低于相应模型组，6、12 h时2组比较差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 2组大鼠肺湿/干重比检测结果比较

表1 2组大鼠肺湿/干重比检测结果比较

*P ＜ 0．05，表 2、3 同

组别治疗组模型组t n 10 10 3 h 6.88±1.98 7.77±1.71 1.07 6 h 5.90±1.00 9.18±4.13 2.44*12 h 7.03±1.50 10.66±1.72 5.03*

2.3IL-8、IL-10检测结果 治疗组 3、6、12 h时IL-8值低于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表 2。治疗 3、6、12 h 时 IL-10 值高于模型组，6、12 h 时差异有统计学意义（P<0.05），见表 3。

表2 2组大鼠IL-8检测结果比较

表2 2组大鼠IL-8检测结果比较

组别治疗组模型组t n 10 10 3 h 8.93±0.81 10.52±0.71 4.67*6 h 8.73±1.08 10.72±0.99 4.28*12 h 9.70±1.06 11.56±1.09 3.89*

表3 2组大鼠IL-10检测结果比较

表3 2组大鼠IL-10检测结果比较

组别治疗组模型组t n 10 10 3 h 0.37±0.35 0.25±0.11 1.05 6 h 0.48±0.30 0.26±0.07 2.33*12 h 0.29±0.10 0.17±0.09 2.78*

2.4病理观察 模型组大鼠注射大肠杆菌后，肺泡上皮细胞严重损伤。其3 h（早期）表现以肺泡高渗出性水肿为特点，见图1；6 h（中期）出现肺泡间隔增宽、炎性细胞浸润，见图2；12 h（晚期）Ⅱ型肺泡上皮细胞沿肺泡腔间隔增生，纤维原细胞增殖，肺泡内出血、过度充气及部分肺泡破裂，见图3，炎性细胞浸润、局部肺实变，见图4。治疗组ALI大鼠3、6、12 h肺组织基本正常，病理变化轻微，见图5。

图1 模型组3 h肺泡高渗出性水肿（HE×400）

图2 模型组6 h肺泡间隔增宽，炎性细胞浸润（HE×400）

图3 模型组12 h过度充气，部分肺泡破裂融合（HE×100）

图4 模型组12 h炎性细胞浸润，局部肺实变（HE×100）

图5 治疗组肺组织均基本正常（HE×100）

3 论讨

细胞因子和趋化因子是一类生物活性多样的活性蛋白，可促进局部和全身的炎症反应。既往研究表明，ALI既是全身炎性反应在肺部的表现，也是机体正常炎性反应过度的结果，肺血管通透性增加与过度或失控性炎症反应有关，炎性细胞和炎性介质构成了ALI炎性反应和免疫调节的“细胞网络”和“细胞因子网络”[4]。在炎症反应中，促炎性介质与抗炎性介质经常处在平衡、失衡相互对立统一的变化之中，因而，深入研究促炎因子和抗炎因子在炎性反应中的变化规律有助于对ALI/ARDS发病机制的认识[5]。

IL-8又名中性粒细胞趋化因子，属于促炎性介质，是由单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞和T细胞等多种细胞产生的一种多肽因子，主要参与内皮细胞的黏附过程。IL-10是抗炎因子的关键，具有广泛的生物学活性，在肺中具有抗感染作用，能抑制单核细胞产生IL-8，故被认为是机体限制内源性反应的内源性机制之一。本研究发现，模型组大鼠的细胞因子IL-8呈增高趋势，IL-10呈降低趋势，证实ALI时存在炎性介质的失控与失衡。因此，笔者认为如果可以有效抑制IL-8的分泌，提高IL-10的活性，就可能从调控细胞炎性因子着手干预ALI的发生和发展。

谷胱甘肽（glutathione）广泛分布于人体肝、肾细胞和红细胞，由GSH和氧化型谷胱甘肽（glutathione oxidized，GSSG）组成，两种形式可以互变[6]。ALI时氧化应激增强，肺组织细胞内氧化-抗氧化失衡，如GSH氧化还原系统表现为GSH氧化型增加而还原型减少，GSH在血中、肺泡上皮衬液及肺部其他细胞中含量降低[7]，同时亦有文献报道显示GSH对大鼠呼吸机相关性肺损伤具有一定保护作用，并认为其作用机制可能与氧化、凋亡有关[8]。

本研究显示，治疗组大鼠IL-8检测值各时段皆低于模型组，且差异均存在统计学意义，IL-10检测值各时段皆高于模型组，在6、12 h差异存在统计学意义，提示应用GSH可有效调控炎性介质，降低ALI的发生率。鉴于目前ALI的发病机制尚未完全明确，ALI的发病机制及抗氧化剂对ALI的其他影响有待进一步研究。

[1] 中华医学会重症医学分会.急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征诊断和治疗指南（2006）[J].中国实用外科杂志，2007，27（1）:1-6.

[2] 黄中伟，唐建忠，袁鼎山，等.还原型谷胱甘肽对急性胰腺炎全身炎症反应综合征的治疗作用[J].中华急诊医学杂志,2005,14（12）:148-150.

[3] 崔华雷，秦明放，鲁焕章，等.急性重症胆管炎致急性肺损伤动物模型的制作[J]，天津医科大学学报,2000,6（4）:40-42.

[4] 陈成，黄建安.急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征预后评估指标研究进展[J].中国呼吸与危重监护杂志，2008，7（2）:81-85.

[5] Goodman RB,Pugin J,Lee JS,et al.Cytokine-mediated inflammation in acute lung injury[J].Cytokine Growth Factor Rev,2003,14（6）:523-535.

[6] 李斌晨，吴明营，蒙革，等.还原型谷胱甘肽临床研究及应用进展[J].中国医疗前沿,2008,3（6）:9-10.

[7] 张宏，刘文操.谷胱甘肽对内毒素致大鼠急性肺损伤的保护作用[J].广东医学,2007,28（5）:701-703.

[8] 胡乃浩，赵文静.还原型谷胱甘肽对大鼠呼吸机相关性肺损伤的保护作用[J].徐州医学院学报，2010，30（1）:14-17.

Effect of Anti-Oxidant on Cytokines of Acute Lung Injury in Rats

LIU Wei,ZHANG Hui,CHANG Cheng,LIN Shuxiang,ZHAO Jinsheng,ZHENG Jie,HUANG Jingfu

Tianjin Children’s Hospital，Tianjin 300074，China

Objective：To investigate the pathogenesis of acute lung injury(ALI),and the effect of anti-oxidants on cytokines of ALI in rats.Methods：Sixty Wistar rats were randomly divided into 2 groups,the model group and the treatment group.The animal model of ALI was established by intraperitoneal injection of Escherichia（E.）coli.The anti-oxidant,reduced glutathione,was injected by the rat tail vein 30 min after injection of E.coli in rats of treatment group.The levels of serum IL-8 and IL-10 were detected 3,6 and 12 h after injection of E.coli.Results：The symptom of ALI appeared 3 h after injection of E.coli,and was more serious after 6 h in rats of the model group.There were anatomical lung edema and bleeding points 12 h after injection of E.coli in rats of the model group.The oxygenation index and lung wet/dry weight ratio reached the diagnostic criteria of ALI.There was no significant change after 3 h,rapid breath after 6 h and only mild lung edema after 12 h in rats of the treatment group.The value of lung wet/dry weight ratio was lower in rats of treatment group than that of model group,which was significantly different after 6 and 12 h treatment(P<0.05).The levels of IL-8 w ere lower at various time points in treatment group than those of model group(P<0.05).The levels of IL-10 were significantly higher at different detection time points in treatment group than those of model group (P<0.05).Conclusion：There was an imbalance and uncontrol of inflammatory mediators in acute lung injury.After application of reduced glutathione,inflammatory mediators can be effectively controlled,thereby reducing the occurrence probability of the acute lung injury.

respiratory distress syndrome,adult disease models,animal glutathione interleukin-8 interleukin-10 cytokines rats,Wistar

*天津市卫生局科技基金项目（项目编号：02KZ14）

300074 天津市儿童医院儿童重症监护病房△

E-mail：chui853@yahoo.com.cn

（2010-03-30收稿 2010-05-25修回）

（本文编辑 陆荣展）

短篇论著