中性粒细胞相关载脂蛋白表达与胃癌进展、转移及预后的关系*

厉金雷 余 震 胡 礼 王蓉蓉 张 行

中性粒细胞相关载脂蛋白表达与胃癌进展、转移及预后的关系*

厉金雷 余 震△胡 礼 王蓉蓉 张 行

目的：探讨中性粒细胞相关载脂蛋白（NGAL）在胃癌组织中的表达及与胃癌进展、转移及预后的关系。方法：应用免疫组化法检测NGAL在102例胃癌、32例正常胃组织中的表达，分析其与胃癌临床病理特征及预后的关系。结果：NGAL在胃癌组织中的阳性表达率为56.9%，明显高于在正常胃组织中的21.9%（χ2=11.938，P<0.01），不同胃癌组织学分型患者NGAL阳性表达差异有统计学意义（χ2=10.180，P<0.05），胃癌患者NGAL表达与浆膜侵犯、TNM 分期、淋巴结转移以及 T 分期呈正相关（rs分别为 0.307、0.211、0.220、0．201，P<0．05 或 P<0．01）。NGAL 表达阳性组和阴性组5年累积生存率分别为24.3%和43.7%，差异有统计学意义（P=0.018）。结论：NGAL在胃癌中表达上调，与胃癌进展和淋巴结转移显著相关，提示预后不良，可作为评价胃癌预后新的生物学指标。

中性白细胞 载脂蛋白类 胃肿瘤 癌 淋巴转移 预后 免疫组织化学

中性粒细胞相关载脂蛋白（neutrophil gelatinase－associated lipocalin，NGAL）是 lipocalin 家族的新成员，由Kjeldsen等[1]于1993年首先发现,分子质量25 ku，由一条多肽链构成,含有178个氨基酸残基。此后研究证明，NGAL与炎症、免疫反应、细胞分化、细胞凋亡、组织重构以及多种肿瘤的发生发展密切相关，NGAL 在胰腺癌[2]、食管癌[3]、卵巢癌[4]等恶性肿瘤中异常表达，并且其表达与肿瘤的浸润、转移、预后密切相关，成为近年来肿瘤转移研究的新热点。本研究采用免疫组化方法检测NGAL在胃癌组织中的表达情况，分析其与胃癌临床病理特征的关系，探讨NGAL作为有效预后指标的可行性。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2004年11月—2005年3月我院102例胃癌患者手术切除的石蜡标本，选取同期在我院32例诊断为胃十二指肠消化性溃疡患者行胃大部切除术标本，离病灶≥5 cm处取胃黏膜组织做对照研究。所有患者均经组织病理学确诊并依据国际抗癌联盟（UICC）第5版进行胃癌TNM分期。所有患者均有完整病历资料，无严重心肺疾病，术前均未行放疗及化疗，非复发再手术病例，非急诊手术病例。所有患者均行手术治疗。随访主要通过电话、查阅门诊复诊病历、上门拜访等方式进行。随访从确诊之日开始，每3个月1次，直至2010年3月或患者死亡或失访。疾病特异生存时间为确诊胃癌之日起至患者死于胃癌或随访截止时间。

1.2主要试剂 羊抗人单克隆抗体购自美国R＆D公司（目录号：AF1757；签号：JBH04）；免疫组化试剂盒（PV－9003）、DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3免疫组织化学染色 采用免疫组化SP法，石蜡切片常规脱蜡、水化、抗原枸橼酸盐微波修复，过氧化氢常温下灭活内源性酶，牛血清封闭非特异性抗原，一抗（工作浓度5 mg/L）4℃孵育过夜，滴加生物素标记二抗37℃孵育30 min，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液37℃孵育30 min，DAB光镜下显色、苏木素复染、常规脱水、透明、中性树胶封片。以PBS代替一抗做阴性对照，以已知胰腺癌阳性片做阳性对照。

1.4结果判定 NGAL蛋白定位于细胞浆,以出现棕黄色颗粒且染色强度高于背景非特异性着色者为阳性。由2位病理学专家独立阅片，确定免疫组化结果。采用IP（Intensity＋Percentages）评分方法[5]，综合考虑染色强度和阳性细胞数。（1）染色强度记分：细胞浆无染色或与背景非特异性着色一致者记0分，淡黄色记1分，棕黄色记2分，棕褐色记3分。（2）阳性细胞数记分：细胞浆无染色评定为0，染色细胞个数<1%评定为1，1%～10%评定为2，>1/10且<1/3评定为3，1/3～2/3评定为4，＞2/3评定为5。以上两项相加即得总分（范围0～8分），＜2分为阴性，2～8分为阳性；2～4分为低表达，5～6分为中等表达，7～8分为高表达。

1.5统计学分析 采用SPSS 16.0软件进行统计学处理。不同临床病理情况患者NGAL表达的差异采用χ2检验；NGAL表达与浆膜侵犯、胃癌TNM分期、淋巴结转移、T分期（原发灶浸润胃壁深度）的相关性采用Spearman等级相关分析；应用Kaplan-Meier法计算疾病累积生存率,生存率差异比较采用Log-rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1NGAL在胃癌和胃正常组织中的表达 NGAL蛋白在胃癌的表达情况，见图1、2。NGAL在32例正常胃组织中7例（21.9%）阳性表达，均为低表达，在102例胃癌组织中58例（56.9%）阳性表达，差异有统计学意义（χ2=11.938，P<0.01）。

图1 胃癌脉管癌栓NGAL蛋白阳性表达（免疫组化SP法×200）

图2 胃癌原发灶NGAL蛋白阳性表达（免疫组化SP法×200）

2.2不同临床病理情况胃癌患者NGAL表达情况比较 不同年龄、性别、肉眼肿瘤分型胃癌患者NGAL阳性表达差异无统计学意义（P>0.05），其余不同临床病理情况胃癌患者NGAL阳性表达差异均有统计学意义（均P<0.05），见表1。NGAL表达与浆膜侵犯、TNM分期、淋巴结转移以及T分期呈正相关（rs分别为 0.307、0.211、0.220、0.201，P<0.05或 P<0.01）。

表1 NGAL蛋白表达与胃癌临床和病理类型关系 例（%）

2.3NGAL表达与胃癌患者预后的关系 胃癌患者中NGAL表达阳性组和阴性组中位生存时间分别为33个月和43个月；5年累积生存率分别为24．3%和43．7%；NGAL表达阳性组的预后明显差于阴性组，2组生存率比较差异有统计学意义（P＝0．018），见图 3。

图3 不同NGAL表达情况胃癌患者的生存曲线

3 讨论

已有研究证实，NGAL可与基质金属蛋白酶（MMP）－9形成复合物，增加 MMP－9活性，并可拮抗基质金属蛋白酶抑制因子（TIMP）－1对MMP－9的抑制作用，促进MMP－9对细胞外基质的降解[6]。本研究显示NGAL表达与浆膜侵犯呈正相关。尤其是脉管癌栓形成的胃癌中，NGAL在脉管癌栓中强表达，提示NGAL可能是肿瘤浸润转移机制中的重要分子。据本研究结果推测胃癌细胞分泌的NGAL蛋白先进入脉管，通过脉管运输到其他部位，参与肿瘤的浸润和转移。此外，NGAL表达与胃癌TNM分期、淋巴结转移、原发灶浸润胃壁的深度呈正相关，表明NGAL阳性表达的胃癌生物学恶性程度较高，容易发生浸润、转移。NGAL在肿瘤浸润转移中的作用机制尚未完全阐明，但已有研究证实NGAL在肿瘤组织的高表达促进了自身与MMP－9形成复合物，此复合物抑制MMP－9自我降解，上调细胞外肿瘤相关性MMP－9的表达，调控细胞外基质血管内皮细胞生长因子的释放，而血管内皮细胞生长因子与胃癌淋巴结转移正相关[7]，此复合物促进新生血管的形成，从而促进肿瘤细胞的增殖[8]。NGAL还可下调E-钙黏蛋白表达，参与表皮生长因子诱导的上皮-间质转化（epithelio-mesenchymal transition,EMT）[2]，在肿瘤的局部浸润和远处转移中发挥重要作用。Yang等[9]发现NGAL可与铁高亲和力结合，独立介导铁的转运，上调铁易感基因的表达，促进肿瘤细胞的增殖。

本研究显示,NGAL阳性组胃癌患者5年累积生存率明显低于阴性组患者，提示NGAL是影响胃癌预后的因素。Fernandez等[8]报道NGAL与MMP－9可以形成复合物，从乳腺癌患者的尿液中排泄，而在正常对照组，未检测到这种复合物。Kubben等[10]研究发现胃癌患者存在类似的情况。尿NGAL检测可作为临床上评价某些恶性肿瘤如胃癌、乳腺癌治疗效果和预后的新指标。

综上，NGAL的表达与胃癌进展、转移及预后密切相关，其阳性表达提示胃癌生物学恶性程度高、侵袭性强、预后不良，可作为评价预后的新生物学指标，指导临床合理选择治疗方案。

[1] Kjeldsen L,Johnsen AH,Sengelov H,et al.Isolation and primary structure of NGAL,a novel protein associated with human neutrophil gelatinase[J].J Biol Chem,1993,268(14):10425-10432.

[2] Furutani M,Arii S,Mizumoto M,et al.Identification of a neutrophil gelatinase-associated lipocalin mRNA in human pancreatic cancers using a modified signal sequence trap method[J].Cancer Lett,1998,122(1-2):209-214.

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[4] Lim R,Ahmed N,Borregaard N,et al.Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL)an early-screening biomarker for ovarian cancer:NGAL is associated with epidermal growth factor-induced epithelio-mesenchymal transition [J].Int J Cancer,2007,120(11):2426-2434.

[5] Bauer M,Eickhoff JC,Gould MN,et al.Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL)is a predictor of poor prognosis in human primary breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat,2008,128(3):389-397.

[6] Yan L,Borregaard N,Kjeldsen L,et al.The high molecular weight urinary matrix metalloproteinase (MMP)activity is a complex of gelatinase B/MMP-9 and neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL).Modulation of MMP-9 activity by NGAL [J].J Biol Chem,2001,276(40):37258-37265.

[7] 张娜，郑海燕，杜华欣，等.VEGF-C、NF-κBp65和COX-2与胃癌淋巴结转移的关系[J].天津医药,2009,37(6):459-461.

[8] Fernandez CA,Yan L,Louis G,et al.The matrix metalloproteinase-9/neutrophil gelatinase-associated lipocalin complex plays a role in breast tumor growth and is present in the urine of breast cancer patients[J].Clin Cancer Res,2005,11(15):5390-5395.

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[10] Kubben FJ,Sier CF,Hawinkels LJ,et al.Clinical evidence for a protective role of lipocalin-2 against MMP-9 autodegradation and the impact for gastric cancer[J].Eur J Cancer,2007,43(12):1869-1876.

The Correlation of NGAL and Clinicopathologic Progress,Metastasis and Prognosis in Gastric Carcinoma

LI Jinlei,YU Zhen,HU Li,WANG Rongrong,ZHANG Xing
The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,Zhejiang 325000,China

Objective:To investigate the expression of neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL)，and the correlation of NGAL with clinicopathologic progression,metastasis and prognosis in gastric carcinoma.Methods：The expression of NGAL was observed in 102 gastric carcinoma tissues and 32 normal gastric tissues by immunohistochemistry.The correlation of NGAL expression with clinicopathologic parameters and metastasis was analyzed.Results：The positive rate of NGAL expression was 56.9%in gastric carcinoma， which was significantly higher than that in normal gastric tissue （21.9%， χ2＝11．938， P<0.01).The expression of NGAL was significantly different in patients with different histological types( χ2=10.180,P<0.05).The expression of NGAL was observed to correlate positively with serosal invasion,TNM stage,lymph node status and T stage (rs=0.307,0.211,0.220 and 0.201,P<0.01 or P<0.05).The five-year cumulative survival rates were 24.3%and 43.7%in the positive and negative NGAL expression groups.Kaplan-Meier curves showed a significant difference(P=0.018).Conclusion:NGAL expression was up-regulated in gastric carcinoma,which was significantly correlated with tumor progression and lymphatic metastasis.The expression of NGAL might be a novel molecular marker to predicate the prognosis of gastric carcinoma.

neutrophils apolipoproteins stomach neoplasms carcinoma lymphatic metastasis prognosis immunohistochemistry

*浙江省自然科学基金资助项目（项目编号：Y207799）

325000 温州医学院附属第一医院普外科（厉金雷，余震，胡礼），病理科（王蓉蓉），外科实验室（张行）

△通讯作者 E-mail：yuzhen0577@yahoo.com.cn

（2010-04-22收稿 2010-06-15修回）

（本文编辑 李国琪）