诸葛菜(Orychophragmus violaceus)查尔酮合成酶基因OvCHS的克隆与序列分析

倪雪莉，黄余磊，梁刚良，鲍笑笑，蒋 明

（台州学院 生命科学学院， 浙江 临海 317000）

诸葛菜(Orychophragmus violaceus)查尔酮合成酶基因OvCHS的克隆与序列分析

倪雪莉，黄余磊，梁刚良，鲍笑笑，蒋 明＊

（台州学院 生命科学学院， 浙江 临海 317000）

根据GenBank发布的基因序列，设计PCR引物，分别从诸葛菜（Orychophragmus violaceus）的花瓣基因组DNA和cDNA克隆到查尔酮合成酶基因，并定名为OvCHS，序列已上传至NCBI数据库，登陆号为EF408918。序列分析表明，OvCHS基因的基因组全长为1263 bp，具一个75 bp的内含子，编码区全长为1188 bp，编码395个氨基酸。与模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）查尔酮合成酶基因AtCHS比较发现，两基因编码区有135个碱基不同，相似性为88.64%，氨基酸序列中仅16个氨基酸残基的差异，相似性达95.95%。

诸葛菜；查尔酮合成酶基因；克隆；表达分析

类黄酮生物合成（flavonoid biosynthesis）是植物体最重要的次生代谢活动之一［1］，其中产生的类黄酮化合物十分丰富，目前已发现6000多种，这些物质包括黄酮、黄酮醇、异黄酮、黄烷酮、黄烷醇和花色素等六大类［2］，它们参与植物多个生理生化过程，在花色、紫外线防御、信号转导、雄性不育、抵抗病虫等方面起着重要作用［3］。查尔酮合成酶（chalcone synthase，CHS；EC 2.3.1.74）是类黄酮合成途径的关键酶，它催化该途径的第一步反应，将香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A转变成查尔酮［4］。近年来，已从啤酒花（Humulus lupulus）［5］、树莓 （Rubus idaeus）［6］、白菜 （Brassica campestrisssp.chinenesis）［7］、小立碗藓（Physcomitrella patens）［8］、草莓（Fragaria×ananassa）［9］、玉米（Zea mays）［10］和蝴蝶兰（Phalaenopsis amabilis）［11］等植物中克隆到了查尔酮合成酶基因。

诸葛菜（Orychophragmus violaceus）又名二月兰，为十字花科诸葛菜属草本植物，原产中国，分布于浙江、江苏、安徽、四川、山东、河南和湖北等省［12］，可用作野菜、饲料和观赏［13］。诸葛菜黄酮类化合物丰富，茎叶中的含量达0.568%，作为野菜食用具一定的抗病保健作用［14］。诸葛菜在营养价值、植物成分、生理生化等方面得以广泛研究，分子层面也有一定进展，已经克隆到了过氧化物酶基因［15］、烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合成酶基因［16］和叶绿体外膜蛋白转运器构件蛋白基因［17］等。但是，诸葛菜类黄酮合成相关基因的克隆研究未见报道。本文分别以诸葛菜花瓣基因组DNA和cDNA为材料克隆查尔酮合成酶基因，在测序的基础上进行序列分析，以明确基因特征和进化地位，为进一步开展基因功能的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

在花期采集刚开放花的花瓣，75%酒精擦拭后用锡铂纸包裹，放入取样袋，迅速投入液氮冷冻并带回实验室，置于-70℃低温冰箱备用。

1.2 实验方法

1.2.1DNA、RNA提取及cDNA合成

取1 g 花瓣用于基因组 DNA 的提取，方法采用 CTAB 法［18］。总 RNA 提取采用 TRIzol法［19］，TRIzolR试剂购自北京鼎国生物技术有限责任公司，取约0.1 g花瓣用于RNA提取；cDNA合成试剂盒SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit购自TaKaRa公司，cDNA第一链和第二链的合成根据其提供的说明书进行；Taqase Plus购自北京鼎国生物技术有限责任公司；dNTP Mix购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2.2 OvCHS基因的克隆

根据 NCBI数据库中的序列信息，设计全长 PCR引物，上下游引物为 OvCHSUP：5’-ATGGTGATGTGTACACCGT-3’和 OvCHSDN：5’-TTAGAGAGGAACGCTGTGC-3’。分别以花瓣基因组 DNA和 cDNA为模板进行 PCR反应，扩增体系为 20 μL，含 1×PCR Buffer，1U的 Taq酶（Promega），0.2 μmol·L-1的 dNTP Mix （上海生工），各 0.2 μmol·L-1引物，30 ng 基因组 DNA 和 50 ng cDNA 模板。PCR 扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性 30 s，55.6℃退火45 s，72℃延伸 60 s，33个循环后，72℃继续延伸7 min。PCR扩增结束后，20 μL PCR产物全部点样于1.2%琼脂糖凝胶进行电泳、拍照和割胶。

1.2.3 PCR产物的回收和测序

PCR产物回收纯化试剂盒购自V-gene公司，回收操作按其提供的说明书进行。取2 μL回收产物，克隆到p-GEM T-easy载体（Promega），置于4℃过夜，然后转入DH-5α大肠杆菌，挑取单个白色菌落于LB液体培养基，37℃振荡培养8 h，经菌液PCR鉴定，各取两个阳性克隆测序。菌液PCR的程序和体系同1.2.2，模板改为0.5 μL菌液。

2 结果与分析

2.1 OvCHS基因的克隆与序列分析

2.1.1 OvCHS基因的克隆

以OvCHSUP/OvCHSDN为引物对，分别从花瓣基因组DNA和cDNA中克隆到了诸葛菜查尔酮合成酶基因，该基因命名为OvCHS（Orychophragmus violaceus CHalcone Synthase），并提交到NCBI基因数据库，登陆号为EF408918。OvCHS基因分别以ATG和TAA作为起始和终止密码子，基因组全长1263 bp，编码区长度1188 bp，编码395个氨基酸（图1）。OvCHS基因具一个长度为75 bp的内含子，位于+195到+269之间。OvCHS基因编码区G+C含量为55.13%，A+T为44.87%。

图1 诸葛菜OvCHS基因的编码区全长序列及其推导的氨基酸序列Fig.1 The complete coding sequence and the deduced amino acid sequence of OvCHS gene from Orychophragmus violaceus

2.1.2 OvCHS蛋白的序列分析

用DNAMAN软件对编码蛋白进行基本特征分析，结果表明：OvCHS的分子量为43044.7，等电点为6.29。395个氨基酸中，碱性氨基酸（Lys+Arg）44个，酸性氨基酸（Asp+Glu）51个，疏水氨基酸（Ala+Phe+Ile+Leu+Val+Trp）142个，极性氨基酸（Cys+Asn+Gln+Ser+Thr+Tyr）79个，各占总氨基酸数目的11.14%、12.91%、37.72%和 20.00%（表1）。

表1 OvCHS基因编码蛋白的氨基酸组成Table 1 Components of amino acid encoded by OvCHS gene

2.2 OvCHS与拟南芥AtCHS基因的序列比较

从NCBI基因数据库下载模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）的查尔酮合成酶基因AtCHS，该基因的登陆号为NM_121396。AtCHS基因的编码区长度也是1188 bp，利用分子生物学软件Clustalx 1.81和GeneDoc进行序列比对，结果表明两基因编码区有135个碱基不同，相似性为88.64%。氨基酸的序列比对结果表明，两者的同源性更高，仅存在16个氨基酸残基的差异，相似性达95.95%（图2）。

图2 OvCHS和AtCHS基因编码的氨基酸序列比对Fig.2 Comparison of amino acid sequences encoded by OvCHS and AtCHS

AtCHS基因具1个长度为86 bp的内含子，比OvCHS基因的内含子多11 bp，两个内含子序列的差异较大，仅50个碱基相吻合（图3）。

图3 OvCHS和AtCHS基因的内含子序列比对Fig.3 Comparison of intron sequences from OvCHS and AtCHS

2.3 OvCHS基因的进化分析

在NCBI基因数据库中下载了18条CHS序列，这些序列分别来自玉米 （Zea mays）（登陆号：NP_001142246）、拟南芥（A.thaliana）（NM_121396）、鹰嘴豆（Cicer arietinum）（CAA10131）、大豆（Glycinemax）（AAB01004）、黄岑（Scutellaria baicalensis）（AAB88208）、北美乔松（Pinus strobus）（CAA87012）、五叶爬山虎 （Parthenocissus quinquefolia）（AAM21773）、葡萄 （Vitis vinifera）（S53314）、挪威云杉（Picea abies）（ABD24228）、甘蓝型油菜（Brassica napus）（AAC31912）、苹果（Malus×domestica）（BAB92996）、矮生西洋梨 （Pyrus communis）（ABI79305）、水稻 （Oryza sativa）（BAA19186）、小麦 （Triticum aestivum）（AAQ19318）、欧洲花楸（Sorbus aucuparia）（ABB89213）、通泉草（Mazus pumilus）（AAN05791）、毛花洋地黄（Digitalis lanata）（CAA05512）、彩叶草（Solenostemon scutellarioides）（ABP57071）。

借助分子生物学软件Clustalx 1.81和GeneDoc对齐CHS序列，再用Mega 3.1构建系统发育树（图4），采用的方法为Neighbor-Joining法。聚类结果表明，葡萄科的五叶爬山虎和葡萄的关系最为接近，聚为一组；禾本科的玉米、水稻和小麦聚为一组，蔷薇科的苹果、矮生西洋梨和欧洲花楸聚为一组；豆科的鹰嘴豆和大豆聚为一组；松科的云杉与北美乔松聚为一组；本研究中的诸葛菜与同为十字花科的甘蓝型油菜和拟南芥聚为一组，但与前者的关系最为接近；唯一例外的是，来自玄参科的通泉草和毛花洋地黄与唇形科的彩叶草和黄岑四种植物聚为一组。

图4 用NJ法构建的查尔酮合成酶进化树Fig.4 Phylogenetic tree of chalcone synthase using NJ methods.

3 讨论

CHS是类黄酮物质合成的关键基因，在植物生长发育和逆境反应过程中起着十分重要的调控作用，是近年来的研究热点之一。已从被子植物、裸子植物、蕨类植物中克隆到了数百个基因，近年来，还从苔藓植物中克隆到了CHS基因［8］，目前在NCBI基因数据库中已有934个CHS基因或基因片段登陆。本研究从十字花科植物诸葛菜中克隆到了一个查尔酮合成酶基因，并定名为OvCHS，基因序列已提交到NCBI数据库，登陆号为EF408918。

OvCHS基因全长1263 bp，编码区长度为1188 bp，编码395个氨基酸。OvCHS具一个内含子，内含子长度为 75 bp，比拟南芥和紫罗兰（Matthiola incana）的内含子短［20,21］，但与白菜的内含子长度相同［7］。OvCHS基因编码蛋白的分子量43044.7，等电点6.29，碱性氨基酸、酸性氨基酸、疏水氨基酸和极性氨基酸各占总氨基酸数目的11.14%、12.91%、37.72%和20.00%。进化分析表明，OvCHS与同为十字花科植物的拟南芥和甘蓝型油菜聚为一组，但与甘蓝型油菜的关系较近，除唇形科和玄参科外，其它不同科的CHS都聚在一组，可能是唇形科和玄参科关系较近的缘故。

OvCHS基因的克隆为研究诸葛菜属植物类黄酮合成途径奠定了基础，实验室将开展转基因研究，以明确OvCHS在抗病反应、UV防御和花色形成等过程中的功能。

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Isolation and sequence analysis of a chalcone synthase gene OvCHS from Orychophragmus violaceus

NI Xue-li，HUANG Yu-lei，LIANG Gangliang，BAO Xiao-xiao，JIANG Ming
（School of Life Science，Taizhou University，Linhai 317000，China）

PCR primers were designed according to known gene sequences registered in GenBank.A chalcone synthase gene，designatedOvCHS，was isolated from petal genomic DNA and cDNA ofOrychophragmus violaceus，respectively.Gene sequence was submitted to NCBI GenBank with accession number of EF408918. Sequence analysis showed that genomic DNA ofOvCHSwas 1263 bp with an intron of 75 bp and a complete coding sequence of 1188 bp in length encoding 395 amino acids. Sequence comparison with model organismArabidopsis thaliana indicatedthat there were 135 bp and 16 amino acids residues variance in coding sequences and protein sequences with similarities of 88.64%and 95.95%，respectively.

Orychophragmus violaceus;chalcone synthase gene;isolation;sequence analysis

周小莉）

S641.2

A

1672-3708（2010）03-0042-07

2010-03-16；

2010-04-09

生命科学学院学生科研项目（09KY19）和台州市科技计划项目（No.08XH02）资助。

蒋 明（1973- ），男，浙江嵊州人，博士，讲师，主要从事植物发育生物学及其分子调控研究。