内源性禽白血病病毒ev/J gp85基因的表达

梁雄燕，杨玉莹，张 莹，钟 蓓 (长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025)

内源性禽白血病病毒ev/J gp85基因的表达

梁雄燕，杨玉莹，张 莹，钟 蓓 (长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025)

从已构建的质粒pGEM-MTCgp85中酶切回收ev/Jgp85基因，通过构建杆状病毒转移载体pFastBac1-ev/Jgp85和重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ev/Jgp85，将ev/Jgp85基因转入Bac-to-Bac高效真核表达系统的Sf9 昆虫细胞进行真核表达。间接免疫荧光试验显示，构建的重组杆状病毒感染的Sf9细胞出现与野生型杆状病毒感染的Sf9细胞阴性对照明显不同的亮绿荧光；Western blot 分析DAB 显色，重组病毒感染的Sf9细胞蛋白显示出约35 ku的阳性条带。结果表明，内源性ev/Jgp85基因在Sf9细胞中得到良好的表达，并且其编码产物完全可以被外源性ALV-J的特异性单抗JE9识别。

内源性禽反转录病毒；ev/J；gp85基因；表达

ev/J(或称为EAV-HP)是在深入研究J亚群禽白血病(ALV-J)的过程中发现的、存在于鸡染色体中与ALV-J具有高度同源性的一类内源性反转录病毒。ev/J主要存在于原鸡属(Gallus)，尽管在原鸡属内不同成员的染色体上表现了不同程度的pol基因的缺失，但基本上拥有与ALV-J相似的5-LTR-gag-pol-env-LTR-3’典型结构[1]。ALV-J主要引起肉鸡的髓细胞性白血病，病毒囊膜基因env是区别于其他亚群而成为一个新亚群的主要依据，由膜表面糖蛋白(SU)基因gp85和跨膜糖蛋白(TM)基因gp37组成[2]。同源性分析表明，J亚群ALV的env与其他外源性亚群A～D的env基因只有40%的同源性，而与内源性病毒ev/J有97%的同源性[3,4]。这种高度同源性表明，ev/J内源性类env基因可能通过基因重组参与了外源性ALV-J的形成。对J亚群分离毒株进行分析，各毒株env基因表现出的不同程度变异，主要集中在gp85基因。尽管亚群分类的标准之一是env的交叉中和反应，然而变异的现象导致许多ALV-J毒株中和性抗血清不能相互中和[5]。

在ALV亚群中，gp85基因所编码的SU蛋白至少涉及诱导中和抗体的抗原表位、感染发生中病毒与细胞受体相互作用的病毒配体等生物学功能[6]，然而高度同源的内源性序列究竟有何生物学功能还不得而知。因此，本研究在J亚群ALV-Jgp85基因研究的基础上，对内源性类J 亚群禽白血病病毒gp85基因进行了表达，以期进一步了解ev/J与外源性病毒及宿主间的复杂生物学关系。

1 材料与方法

1. 1 材料与主要试剂

pGEM-MTCgp85质粒为自制。杆状病毒转移载体pFastBac1、转座宿主菌DH10Bac(含杆状病毒穿梭质粒Bacmid和Helper辅助质粒)购自Ivitrogen公司。抗ALV-J单抗JE9、大肠杆菌DH5α、Sf9细胞和野生型杆状病毒由扬州大学微生物实验室提供。Lipofectin转染试剂为Gibco/BRL公司产品。T4连接酶为Promega公司产品。dNTP、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶和DNA Marker为宝生物工程(大连)有限公司产品。QIA quick琼脂糖回收试剂盒为QIAGEN公司产品。胎牛血清购自Hyclone公司。FITC标记的羊抗鼠IgG，HRP标记的兔抗鼠的IgG，二氨基联苯氨(DAB)均为Sigma公司产品。IPTG、X-gal、预染蛋白Marker、M13/pUC通用上、下游引物购自上海生物工程公司。

1.2 杆状病毒重组转移载体pFastBac1-ev/J gp85的构建与鉴定

取含质粒pGEM-MTCgp85质粒的DH5α接种于含Ampicillin(100 μg/mL)LB液体培养基，37 ℃ 200 r/min振荡培养过夜，利用碱裂解法小量提取质粒，以限制性内切酶BamH I/PstI双酶切，用QIAGEN公司的QIAquick琼脂糖核酸回收试剂盒纯化目的条带。

将回收纯化的ev/Jgp85基因7 μL和杆状病毒转移载体pFastBac1 1 μL，10×Ligation Buffer 1 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，4 ℃下连接过夜制备重组杆状病毒转移载体pFastBac1-ev/Jgp85，并转化入用CaCl2法制备感受态大肠杆菌DH5α中进行LB平板蓝白斑筛选，挑取白色菌落接种于含Ampicillin(100 μg/mL)的LB液体培养基培养，利用碱裂解法小量提取质粒。利用限制性内切酶BamH I和PstI进行双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳检测鉴定插入的目的片段。

1.3 重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ev/J gp85的构建及鉴定

用CaCl2法制备感受态大肠杆菌DH10Bac，按Bac-to-Bac表达系统说明书将重组的杆状病毒转移载体转入DH10Bac中，接种至KGTIX LB培养基(含50 μg/mL卡那霉素、7 μg/mL庆大霉素、10 μg/mL四环素、40 μg/mL IPTG和200 μL/mL X-gal)，筛选白色菌落。

主要步骤为：取100 μL DH10Bac感受态细胞，加入约10 ng的pFastBac1-ev/Jgp85重组质粒，轻轻混匀后冰浴30 min，42 ℃热休克45 s，迅速置冰水混合物中1～2 min，然后加入900 μL的SOC培养基，37 ℃ 225 r/min振荡培养4 h，然后用SOC培养基作10-1、10-2、10-33个稀释度，每个稀释度分别取200 μL涂布KGTIX LB平板，37 ℃培养24～48 h，至菌落出现。

筛选的菌落重新接种KGTIX LB培养基纯化2次，接种含50 μg/mL的卡那霉素、7 μg/mL的庆大霉素、10 μg/mL的四环素的LB液体培养基，37 ℃ 300 r/min振荡培养过夜，按改良的碱裂解法提取重组穿梭载体Bacmid-ev/Jgp85 DNA。用M13/pUC通用上、下游引物对所提取的Bacmid-ev/Jgp85 DNA进行PCR鉴定(设不含ev/Jgp85基因的Bacmid DNA的阴性对照)。鉴定阳性的Bacmid-ev/Jgp85 DNA用于转染Sf9细胞。

PCR反应体系为50 μL：10×PCR Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL、50 pmol上下游引物引物各1 μL、25 mmol/L MgCl23 μL、TaqDNA聚合酶0.5 μL、Bacmid-ev/Jgp85 DNA模板1 μL、去离子水37.5 μL。循环条件为94 ℃ 5 min； 94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min ，共33个循环；72 ℃ 10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 重组杆状病毒rBacmid-ev/J gp85的制备

将处于对数分裂期的Sf9细胞用Grace完全培养基轻轻吹下，稀释至4.5×105个细胞/mL，按2 mL每个培养皿将细胞悬液加入直径35 mm培养皿(密度约为50%)，贴附40 min。同时取2个灭菌指形管均加100 μL无任何添加物的pH6.2的Grace培养液命为A、B管，在A管加入5 μL Bacmid-ev/Jgp85 DNA混匀即为转染A液，在B管加入6 μL的Lipofectin混匀即为转染B液。将2管液体混匀室温放置15 min，加入800 μL无任何添加物的Grace培养液中命为C液，吸去Sf9细胞培养皿中培养液，将C液加入Sf9细胞表面，27 ℃孵育6 h。吸去转染C液，加入2 mL含10% FCS的完全培养基，27 ℃继续培养至Sf9细胞出现明显病变。通过收集病变明显Sf9细胞上清即为P1代重组病毒命为rBacmid-ev/Jgp85。用P1代重组病毒接种对数生长期的Sf9细胞，27 ℃培养5～7 d至细胞完全破碎时，收集培养上清命为P2代重组病毒，重复1次扩增P3代重组病毒用于重组蛋白表达的鉴定。不含ev/Jgp85基因的Bacmid DNA阴性对照以同样的方法同时进行。

1.5 重组蛋白在Sf9细胞中的表达检测

收获P3代重组杆状病毒感染72～96 h，出现明显病变的Sf9细胞，以抗ALV-J的单克隆抗体JE9为一抗，FITC标记羊抗鼠IgG为二抗进行间接免疫荧光反应检测，亮绿色荧光者为阳性。以抗ALV-J的单克隆抗体JE9为一抗，HRP标记兔抗鼠IgG为二抗进行重组蛋白Western-blotting 检测，2种检测均设立阴性对照。

2 结果与分析

1.10 kb DNA Marker；2. pGEM-MTCgp85酶切结果图1 ev/J gp85的酶切回收 Figure 1 Recovey of ev/J gp85 by Enzyme digested of pGEM-MTCgp85

2.1 ev/J gp85酶切回收

用BamH I/PstI双酶切pGEM-MTCgp85，1%琼脂糖凝胶电泳，显示成功切出一条约940 bp的条带，与ev/Jgp85预期大小相符(图1)。

2.2 重组转移载体pFastBac1-ev/J gp85的酶切鉴定

pFast Bacl-ev/Jgp85转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过Amp抗性筛选阳性克隆，小量提取质粒后，BamH I和PstI双酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳，显示ev/Jgp85基因片段插入到pFastBac1载体中。重组转移载体pFast Bacl-ev/Jgp85的酶切图谱如图2所示。

2.3 重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ev/J gp85构建与鉴定

重组转座质粒pFastBac1-ev/Jgp85转化DH10Bac感受态细菌进行转座反应后，挑取白色菌落在KGTIX的平板上经2次纯化排除假阳性，进行质粒的小提。对重组的Bacmid-ev/Jgp85进行了PCR鉴定，经1%琼脂糖凝胶电泳后，可见一条约1 000 bp的特异性片段(图3)，与预计大小相符，而未发生转座的Bacmid阴性对照未能扩增出相应的条带，证明内源性ev/Jgp85已经成功地转座到Bacmid穿梭载体中。

1.10kbDNAMarker;2.BamHI和PstI双酶切结果图2 重组转移载体酶pFastBac1-ev/Jgp85切鉴定Figure2 EnzymedigestionanalysisofrecombinantvectorpFastBac1-ev/Jgp851.10kbDNAMarker;2.rBacmid-ev/Jgp85PCR产物;3.Bacmid对照的扩增产物图3 重组穿梭质粒Bacmid-ev/Jgp85PCR鉴定Figure3 EnzymedigestionanalysisofrecombinantshuttleplasmidBacmid-ev/Jgp85

2.4 重组病毒rBacmid-ev/J gp85的制备

将重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ev/Jgp85通过脂质体转染对数生长期的Sf9细胞，27 ℃培养72 h后，细胞开始出现病变，细胞核肿大，细胞内有形态不规则的透明颗粒，并逐渐增大，96 h后细胞开始死亡，待细胞基本都崩解时收获上清，离心过滤后即为P1代重组杆状病毒。为了表达需要，将P1病毒在Sf9细胞上扩增出了高滴度的P2代重组病毒和P3代重组病毒。

2.5 表达物间接免疫荧光检测

用丙酮∶乙醇(3∶2)固定重组杆状病毒和野生杆状病毒感染的Sf9细胞，以抗ALV-J单克隆抗体JE9作为一抗，FITC标记的羊抗鼠IgG作为二抗进行荧光染色，结果感染重组杆状病毒rBacmid-ev/Jgp85的Sf9细胞胞浆内出现亮绿色荧光(图4A)，而野生杆状病毒感染的Sf9细胞的对照呈阴性反应(图4B)，说明内源性ev/Jgp85基因在Sf9细胞中得到良好的表达。

A.重组杆状病毒rBacmid-gp85-like感染Sf9细胞72 h后的间接免疫荧光检测结果图 B.野生杆状病毒Bacmid阴性对照图4 表达物间接免疫荧光检测Figure 4 Indirect IFA staining of Sf9 cells infected with recombinant baculovirus encoding ev/J gp85

2.6 表达产物的SDS-PAGE 及Western blot 分析结果

1.野生杆状病毒DH10BAC 感染的Sf9 细胞;2.重组杆状病毒rBacmid-ev/J gp85 感染的Sf9细胞;3.重组杆状病毒rBacmid-env4817感染的Sf9细胞; 4.预染蛋白质Marker图5 ev/J gp85 基因表达产物的 Western blot 分析Figure 5 Western blot analysis of ev/J gp85 gene product expressed in Sf9 cells

分别收集重组杆状病毒rBacmid-ev/Jgp85和野生杆状病毒DH10BAC 感染96 h 后的Sf9 细胞，经SDS-PAGE 电泳后，重组病毒和野生病毒感染的Sf9 细胞的蛋白质条带无明显区别。但将凝胶转移到硝酸纤维素膜上，经Western blot 分析DAB 显色，重组病毒感染的Sf9 细胞中出现一条约35 ku条带，大小与非糖基化的ALV-Jgp85的分子量(36 ku)大小接近，而空Bacmid转染产生的野生杆状病毒感染的Sf9 细胞中未出现相应的条带(图5)。这进一步证实了ev/Jgp85基因在杆状病毒表达系统中的得到了表达。

3 讨论

内源性反转录病毒ev/J是在深入研究20世纪80年代后期新发现的引起鸡髓细胞性白血病的J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的过程中在鸡的基因组中发现的[1]。在目前已知的所有脊椎动物的反转录病毒中，只有鸡(准确地说是家鸡，其祖先是红原鸡)的染色体基因上存在与ALV-J有如此高同源性的对应内源性病毒序列，其env基因同源性高达97%[ 3,4]。env基因高度的同源性预示着其编码物可能潜在的具有与外源性病毒env基因编码物具有类似的功能及活性。

关于内源性ev/Jgp85基因编码物的生物学活性，Caroline等[7]分别将ev/J4.1和ALV-J Hc1 的env克隆入MLV，构建了伪型重组MLV，在DF1细胞上与HPRS-103 ALV-J一起进行了干扰试验，结果表明ev/J4.1env完全可以与Hc1env和HPRS-103的感染相互干扰。说明它们拥有共同的感染通道和细胞受体。

为了解内源性ev/J SU的生物学活性状况，本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒真核表达系统表达了源自商品肉鸡的ev/Jgp85基因。结果以抗ALV-J的单克隆抗体JE9为一抗的间接免疫荧光试验，构建的重组杆状病毒感染的Sf9细胞显示出与野生型杆状病毒感染的Sf9细胞阴性对照明显不同的亮绿荧光；经Western blot分析显示，重组病毒感染的Sf9细胞蛋白显示出约35 ku的阳性条带，大小与非糖基化的ALV-Jgp85的分子量(36 ku)大小接近。

试验表明,内源性ev/Jgp85基因在Sf9细胞中得到良好的表达，并且其编码产物完全可以被外源性ALV-J的特异性单抗JE9识别，证实了内源性ev/Jgp85基因重组表达物与外源性ALV-J囊膜糖蛋白之间具有生物学相关性，为进一步研究内源性内源性ev/J奠定了基础。但本研究与杨玉莹等[6]表达的外源性ALV-Jgp85 SU(54 ku)有一定的差异，这一差异的原因是否是由于糖基化不完全造成，还有待进一步研究。

[1]Benson S J, Ruis B L, Fadly A M,etal. The unique envelope gene of the subgroup J avian leukosis virus derives from ev/J proviruses, a novel family of avian endogenous viruses [J]. Virol, 1998, 2:10157～10164.

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[6]杨玉莹，秦爱建，赵振华，等. J亚群禽白血病病毒囊膜基因gp85的克隆与表达[J].中国兽医科技, 2003,33(7): 3～6.

[7]Caroline D, Denis S, Gaelle P,etal. Interference between avian endogenous ev/J 4.1 and exogenous ALV-J retroviral envelopes[J]. Virol, 2003,84:3233～3238.

2008-09-12

国家自然科学基金资助(30460098)

梁雄燕 (1982-)，男，湖北襄樊人，硕士研究生，研究方向为动物病原微生物学与分子生物学.

杨玉莹，E-mail: yangyycn@gmail.com

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.01.016

Q786

A

1673-1409(2009)01-S054-05