局部应用L-精氨酸对糖尿病小鼠创面愈合的影响

陈晓华 于攀 李世荣 王珍祥

局部应用L-精氨酸对糖尿病小鼠创面愈合的影响

陈晓华 于攀 李世荣 王珍祥

目的研究局部应用L-精氨酸对糖尿病小鼠创面治疗效果的影响。方法建立链脲霉素（Streptozotocin，STZ）诱导的Ⅰ型糖尿病小鼠创面模型；昆明小鼠随机分为正常对照组（A组）、糖尿病对照组（B组）、糖尿病精氨酸治疗组（C组），糖尿病小鼠创面模型建立后,观察及测量伤后0、4、8、14、16 d时创面愈合面积、肉芽生长情况、组织形态学改变、羟脯氨酸（OHP）含量。结果C组创面愈合明显加快（P＜0.05），创面成纤维细胞数量、胶原生成增多，OHP含量增加。结论局部应用L-精氨酸，通过加快肉芽生成，增加创面成纤维细胞数量，能促进糖尿病创面愈合。

糖尿病L-精氨酸创面愈合一氧化氮

糖尿病创面具有愈合明显延迟的现象，在其分子机制中一氧化氮（Nitric Oxide，NO）占了很重要的地位[1]。L-精氨酸是NO合成的唯一底物，口服精氨酸可改善伤口愈合，增加创伤部位胶原含量和组织抗张强度[2]，但其局部应用对于糖尿病创面愈合的影响报道较少。本研究拟通过对糖尿病小鼠创面局部应用精氨酸，探讨其可否促进糖尿病创面的修复及机制，为其临床应用提供客观的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂

SPF昆明小鼠75只，体重（27±2）g（第三军医大学实验动物中心）。L-精氨酸（上海生工生物工程技术服务有限公司），STZ（Sigma公司），戊巴比妥钠（Merk公司），OHP含量测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 糖尿病创伤模型的建立[3-4]

将小鼠连续5 d腹腔注射STZ（45 mg/kg），第5次注射后，小鼠禁食不禁水10 h，由小鼠尾静脉取血，快速血糖仪测量空腹血糖水平。空腹血糖浓度高于11.1 mmol/L，且连续出现多饮、多食、多尿者选为糖尿病模型小鼠。如血糖浓度低于11.1 mmol/L，以同样浓度STZ注射3 d继续诱导，使其血糖浓度高于11.1 mmol/L。模型建立后4周，小鼠背部10%硫化钠脱毛，温水清洗，拭干。次日，以戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，用组织剪在小鼠背部剪去直径约1 cm的圆形皮肤组织。

1.3 实验分组及给药[5]

将L-精氨酸溶解于去离子水中，制成浓度为100 g/L的溶液。动物分为3组：正常对照组（A组）、糖尿病对照组（B组）和糖尿病精氨酸治疗组（C组），每组25只小鼠。每天在C组小鼠创面喷洒注射L-精氨酸溶液0.15 mL，A组和B组创面使用同量的去离子水。

1.4 计算创面愈合率

于伤后0、4、8、14、16 d时测量创面面积，计算创面愈合率。测量方法是用透明方格纸描绘创口，扫描入电脑后，以Adobe Photoshop CS2测量创面面积。

1.5 标本取材及处理

每组动物分别于伤后第4、8、14天切取愈合创面组织，固定于4%多聚甲醛中，常规石蜡包埋切片，沿凸起最高点纵行切片，切片厚5 μm，行常规HE染色。

1.6 创面组织中OHP含量测定

创面组织准确称重后，加9倍等渗盐水制成10%的匀浆，离心，将上清稀释成2%的浓度，按OHP含量测定试剂盒说明进行测定。

1.7 统计学处理

计量资料数据以（均数±标准差）表示，用SPSS 12.0统计软件进行t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 糖尿病小鼠创面模型的建立

STZ（45 mg/kg）注射后第4周，小鼠空腹血糖浓度为（20.62±1.23）mmol/L，没有动物死亡，且连续出现多食、多饮、多尿症状。对各组小鼠实施创面形成术后，动物无死亡。

2.2 形态学观察

实验A、C组肉芽组织生成好，炎症反应轻，创面上皮化时间早，到创伤后第14天基本完全愈合，且皮肤张力强度同正常皮肤；实验B组肉芽组织色暗、水肿，生长不良，炎症反应较重，创面愈合延迟，且皮肤张力较低（图1）。

2.3 组织学观察

光镜下可见创伤后A组和C组成纤维细胞数量较多，血管增生及胶原形成活跃。至创伤后第14天，成熟成纤维细胞增多，细胞排列成束状，炎症细胞很少。B组愈合过程中有较多炎性细胞，新生毛细血管、成纤维细胞及胶原生成较另两组少，创伤后第14天成纤维细胞排列紊乱，炎性细胞较另两组多（图2）。

图1 创伤后第8天各组创面情况

图2 创伤后第8天各组HE染色（400×）

2.4 创面愈合率

B组比A组愈合明显延迟；C组与B组相比，在伤后第4天创面愈合率显著增加（P＜0.05）（表1）。

表1 各组创面愈合率的比较(%，X±S，n=8)

2.5OHP含量

3组创面羟脯氨酸水平在创面形成后即明显下降，之后逐渐增高。创面形成后第4天起各时相点A、C组的羟脯氨酸水平均显著高于B组（表2）。

表2 各组羟脯氨酸含量比较(mg/g，X±S，n=3)

3 讨论

L-精氨酸是体内蛋白氮重要的载体、一种条件必需氨基酸，其可经一氧化氮合酶(NOS)、精氨酸酶生成一氧化氮（NO）、脯氨酸等活性分子，对创面愈合过程发挥重要的调节作用[6]。NO可参与并促进皮肤组织创伤恢复的整个过程[7]，其作用表现在诱导成纤维母细胞、上皮细胞、内皮细胞和角质细胞的增殖与分化、增进血管生成、参与基质的沉积和重塑、调节创伤愈合炎症反应中多种细胞因子的活性等。有研究表明在创伤后糖尿病小鼠皮肤组织中NO生成明显减少[8]。本研究采用局部应用L-精氨酸的方法观察其对糖尿病小鼠创面愈合的影响，结果表明：精氨酸对糖尿病创面具有明显的促愈作用。实验C组创面愈合率明显高于B组，创伤后创面快速收缩，肉芽组织形成良好；在愈合晚期，创面愈合时间提前2～3 d，并呈现更好的皮肤愈合及毛发生长。

在局部应用L-精氨酸后，实验C组成纤维细胞增殖较快，胶原纤维排列较整齐，炎症反应发生较B组发生早。糖尿病创面炎症反应的延迟和失调是其难愈的主要原因之一[9]。局部应用L-精氨酸可使创面中延迟出现的炎症反应得到改善，表明其经一氧化氮合成酶(NOS)途径产生NO，可影响创面早期的炎症反应等。

羟脯氨酸是胶原蛋白的重要组成部分，对胶原合成、细胞外基质产生、创面修复和组织重塑至关重要，其含量可以反映创伤愈合的状况。创伤后第4天开始C组明显高于B组，表明局部应用L-精氨酸可促进胶原合成，从而加快创面愈合。

本研究通过简单的方法建立了稳定的糖尿病小鼠创面模型，证实了局部应用L-精氨酸可通过促进成纤维细胞增殖、胶原合成及改善创面炎性反应延迟，明显促进糖尿病创面的愈合。

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Effect of L-arginine on the Wound Healing of Diabetic Mice

CHEN Xiaohua1,YU Pan2,LI Shirong2,WANG Zhenxiang2.
1 Shanghai Time Plastic Surgery Hospital,Shanghai 200021,China;2 Department of Plastic Surgery,Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China.

ObjectiveTo investigate the effect of L-arginine used in the wound of mice with diabetes.MethodsType I DM mice induced by streptozotocin were used as the animal model.Seventy five male KM mice were used in this study and were randomly divided into group A(normal control,n=25),group B(diabetic control,n=25)and group C(diabetes with L-arginine administration,n=25).The percentage of healing areas,the granulation tissue formation,the histological and morphological changes and the content of hydroxyproline were observed and measured on the 0,4,8,14,and 16 days after injury.ResultsThe treatment group C showed better wound healing than the group B.The contents of fibroblasts,collagen and OHP increased,compared with those in the group B(P＜0.05).ConclusionThe local application of L-arginine could promote the healing of wounds in diabetic mice by stepping up the granulation tissue formation and increasing fibroblasts quantity in trauma.

Diabetes;L-arginine;Wound healing;Nitric Oxide

R619+.6

A

1673-0364（2009）04-0205-03

2009年3月29日；

2009年5月9日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.08.007

200021上海市上海时光整形外科医院（陈晓华）；400038重庆市第三军医大学西南医院整形外科（于攀，李世荣，王珍祥）。