含银涂层人工关节抗感染性能的实验研究

陈治宇　张　晖　阮正上　黄　强

【摘要】 目的 建立兔股骨假体置换术后感染模型，探讨覆盖金属银/羟基磷灰石层的抗菌人工关节的抗感染性能。方法 采用普通的未镀银的人工关节假体做对照组，以覆盖银/羟基磷灰石层的人工关节假体为实验组，术后观察动物模型情况。结果 实验组术后感染情况明显优于对照组(P<0．05)。结论 覆盖银/羟基磷灰石层的人工关节假体不仅具有良好的生物相容性，还具有抗菌作用。

【关键词】人工关节假体；感染；银涂层

人工关节假体自100多年前应用于临床以来，虽获得巨大的发展，但有许多问题尚需解决，如植入人体后产生的感染问题。感染是关节置换术后的一个灾难性的并发症，给患者带来巨大的经济压力和精神打击。抗菌剂是指能够有效抑制微生物生长繁殖或可杀死病菌的物质。银系抗菌剂是抗菌效率最高的无机广谱抗菌剂，银抗菌剂被广泛用于抵御伤口和烧伤的感染。本课题在关节表面覆盖金属银/羟基磷灰石层，此种人工关节假体不仅具有良好的生物相容性，还具有抗菌作用^[1]。

1 资料与方法

1．1 材料 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant staphy1ococcus aureus，MRSA)由四川大学华西医院检验科细菌培养室提供；兔股骨假体由本课题组自行设计提供(图1)；电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)由四川大学分析检测中心提供；实验动物为新西兰大白兔24只，体质量为3．2~4．8 kg，骨骼结实，被毛光泽，集中饲养，饲养室温度20℃，湿度60%。

1．2 动物模型的建立 共分两组，分别采用普通的未镀银的人工关节假体做对照组，以覆盖银/羟基磷灰石层的人工关节假体为实验组，氯胺酮50 mg／kg肌肉麻醉，以右侧股骨转子为中心、作长4 cm的弧形切口，从右股前与外侧肌间隙进人髋关节，切除股骨头并保留股骨距2 mm。以自制髓腔锉扩髓。两组分别插入未镀银的人工关节假体和含银/羟基磷灰石涂层的人工关节假体，保持20°~30°的前倾角，逐层缝合(图 2)。MRSA使用前于37℃培养1 d，生理盐水配成菌液，用VITEK比浊仪粗测细菌浓度约1×107 CFU后，2h以内使用。共注入MRSA细菌混悬液0．6 ml，1×107 CFU的MRSA(分2次，第1次0．3 ml注入髓腔，第2次0．3 ml在关闭伤口前，注入关节腔)。

1．3 检测指标 术后喂养4周，定期观察体温，一般情况，并检测血常规，以及血清C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)。4周后抽取右侧髋关节关节液并处死动物，观察右侧髋关节切口愈合情况，是否有红、肿、窦道，观察右髋关节的活动度。分别在关节囊、髋臼窝及股骨髓腔内各取组织1块，每块重约0．5 g，行细菌培养，2块或以上组织培养MRSA阳性则判定为感染；并对关节液进行培养，如果培养MRSA阳性则判定为感染^[2-3]。电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)检测两组动物血中的银离子浓度，并观察是否存在银沉积病。

1．4 统计学方法 计量资料采用(x±s)表示，采用t检验，计数资料采用百分比表示，采用卡方检验，以P<0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 大体观察情况的比较 实验组切口全部愈合，局部无红肿，无窦道溢脓，多数站起活动，对照组有5只大白兔切口局部红肿，且活动量少。实验组关节内及假体周围组织未见明显感染迹象，对照组有8只大白兔关节内发现假体周围有炎性肉芽组织和黏稠样脓性分泌物。

2．2 体温 两组动物的体温均波动在38．5℃~39．5℃，但实验组的体温明显低于对照组(P<0．05)。

2．3 细菌培养情况比较 实验组仍有2只兔的髋关节存在感染，感染率为16．66%；对照组有12只兔的髋关节存在感染，感染率为100%，两组比较差异有统计学意义(P<0．001)。

2．4 两组实验室检查情况比较 两组白细胞计数在2周末差异无统计学意义(P=0．09)，在4周末差异有统计学意义(P<0．05)，实验组CRP值与对照组差异有统计学意义(P<0．001)。

2．5 假体的安全性 电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)检测发现实验组血中的银离子浓度(1．69±1．01)ppb，显著高于对照组血中的银离子浓度(0．031±0．008)ppb。实验组未发现银沉积病，假体周围组织切片也没发现异物肉芽肿和炎症反应(图3)。

3 讨论

全髋关节置换术后急性感染多数是金黄色葡萄球菌感染和表皮葡萄球菌。据美国疾病控制中心报道，35%的金黄色葡萄球菌为甲氧西林耐药^[4]。耐药的金黄色葡萄球菌属于高毒性致病菌，在本实验中，对照组细菌培养全为阳性，达到了感染模型制备的目的。本研究中实验组的体温、CRP、细菌培养感染率等指标都明显优于对照组，表明金属银/羟基磷灰石层的抗菌人工关节具有优良的抗感染功效。

Anagnostakos等统计初次人工髋关节置换术后感染发病率为1%~2%^[5]，生物被膜(biofilm)是引起人工关节假体感染的主要因素之一。生物被膜是细菌为适应生存环境而黏附于生物材料或活性组织表面，并包被在自身产生的黏液性蛋白多糖基质中而形成的细菌群落或微克隆，它是一个不断变化的动态结构^[6]。当人工关节假体植入体内后，表面立即被血液成分(蛋白、血浆大分子、红细胞、血小板)覆盖，形成所谓的条件膜，细菌通过化学作用，如范德华力、酸根、静电、疏水性作用及蛋白结合等，黏附在条件膜和假体表面。机体免疫力正常时，多数浮游菌被杀死，少数残存细菌黏附到材料表面之后调整基因表达，在生长繁殖的同时分泌大量胞外黏质物(extracellular slime substance，ESS)，将多个细菌粘连到一起形成生物被膜。平时，细菌多以休眠状态藏匿于生物被膜中，当有特定触发因素时即从休眠或静止状态转变为致病菌。感染一旦发生就会使假体产生松动，丧失正常功能，给患者带来极大的痛苦，且感染还会反复发作，迁延难愈^[7]，而常规的抗生素疗法很难奏效，因而人工关节置换术后感染的预防和治疗一直是该领域中一项极其重要的课题。继而有人研究成功在普通聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)骨水泥中添加抗生素而在人工关节假体表面形成抗生素骨水泥(antibiotic impregnated bone cement)层来作为解决感染较为常用的方法^[8]。但经使用后发现，抗生素骨水泥长期释放低浓度抗生素，容易使细菌产生耐药性，而且随着添加抗生素的增多，过敏反应发生的概率也很高，且一旦发生处理困难，必须取出假体，这不仅会给患者带来极大的痛苦，而且还要带来过重的经济负担。

本研究中的抗菌人工关节假体表面有金属银涂层，因而当其与体液等氧化介质接触后，金属银将逐渐被氧化而释放出银离子，当微量银离子到达微生物细胞膜时，因细胞膜带有负电荷，银离子首先会依靠库伦力牢固吸附在细胞膜上，然后进一步穿透细胞壁进入病菌内，与病菌生物体内的蛋白质、核酸中存在的巯基(-SH)、氮基(-NH2)等含硫、氨的官能团发生反应，使病菌的蛋白质凝固，破坏病菌的细胞合成酶的活性，使细胞丧失分裂增殖能力而最终消亡，从而达到抗菌并减少或消除人工关节假体相关感染发生的目的^[9]。金属银的氧化速度，或者说释放银离子的速度，或者说银离子的杀菌效力与金属银的表面积相关。因为金属银表面积越大，与体液等氧化介质接触面积就越大，越容易氧化，同时与细菌接触机会也越大，杀菌效率也就越高。本涂层中银颗粒直径可以达到10~50 nm，这就明显增加金属银的表面积，从而增加与细菌接触的机会，因此杀菌效力也就显著提高^[10]。

在本实验中，未发现银沉积病，血中银离子浓度也较低。一项覆盖银的外固定系统的研究中表明，发现银无细胞毒性，也无遗传性毒性(genotoxic)^[11]。有研究采用人成骨细胞体外检测含纳米银骨水泥的细胞毒性，结果显示在纳米银组和对照组之间无显著差别，说明纳米银离子在有效浓度内无毒性^[12]。Tweden发现银离子浓度高达1200 ppb时对成纤维细胞仍无毒性^[13]。现今应用的表面微孔非骨水泥关节假体表面也可镀一层适当厚度的银，银颗粒位于微孔孔隙里，从而达到既有利于骨长入又可发挥银的抗菌效用。本研究提供一种新型的抗菌人工关节假体，其推广需要进一步的临床试验的证据。

参考文献

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