协同凝集实验诊断副溶血性弧菌感染的初步探讨

266071 济南军区青岛第二疗养院检验中心 于庆潭 郑红霞253000 济南军区总医院 李 伟

协同凝集实验诊断副溶血性弧菌感染的初步探讨

266071 济南军区青岛第二疗养院检验中心 于庆潭 郑红霞253000 济南军区总医院 李 伟

目的 建立了一种快速简便的副溶血性弧菌的检测方法。方法 将抗副溶血性弧菌多克隆抗体包被到金黄色葡萄球菌Cowan I株上制成SPA菌体试剂，建立协同凝集试验(COA)，检测样品中可能的副溶血性弧菌。结果 COA检测的敏感性为2×106cfu/mL，检测过程为5 min。112份临床标本的测定结果与培养法相比较，COA的特异性、敏感性、诊断符合率分别是100%、94.2%、97.3%。结论 本研究为发展简便、敏感和快速的副溶血性弧菌的协同凝集检测试剂鉴定基础。

副溶血性弧菌；协同凝集试验；检测方法

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是海洋和盐湖中分布广泛的一种嗜盐性病原菌。广泛分布在近海岸的海水、海底沉积物、鱼类、贝类中，适应于高浓度(6%)食盐的环境中生长，在不含食盐的培养基中不能生长。该菌是亚于霍乱弧菌的一种常见肠道致病菌，其污染会给海水养殖业带来严重损失，还会引起人类腹泻等肠道疾病及食物中毒，出现腹泻呈水样或血样便、腹部痉挛、恶心、呕吐和头痛等症状[1-6]。自2001年以来，副溶血性弧菌性食物中毒爆发已经成为中国最常见的食源性疾患，副溶血性弧菌性食物中毒的起数和人数一直处于第一位。

多数金黄色葡萄球菌的细胞壁内含有一种特殊的蛋白质，称为葡萄球菌A蛋白质 (staphylococcal protein A,SPA)，SPA的分子量为42 000，等电点为5.1，一个分子内有4个相似的活性部位，能与人及多种哺乳动物(猪、兔、豚鼠等)血清中IgG类抗体的Fc段非特异性结合。IgG的Fc段与SPA结合后，两个Fab段暴露在葡萄球菌菌体表面，仍保持其结合抗原的活性和特异性，当其与特异性抗原相遇时，能出现特异的凝集现象。在此凝集中，金黄色葡萄球菌菌体形成了反应的载体，故称协同凝集试验(coagglutination test)。协同凝集试验可用于微生物的快速诊断、定种及定型，以协助传染病的早期诊断。

本实验应用协同凝集试验建立了副溶血性弧菌的检测方法，为制备副溶血性弧菌的协同凝集检测试剂盒鉴定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料 菌株来源：疑似副溶血性弧菌标本92份，取自2007年7～9月间医院就诊病人。按培养检测法接种碱性蛋白胨水37℃增菌鉴定。阳性对照本院检验室提供，菌液浓度为1.3×108cfu/mL。大肠埃希菌20份，伤寒沙门菌10份由本科细菌室提供。免疫原与反应原：将培养后副溶血性弧菌用0.5%的甲醛PBS配成浓度约10亿/mL的菌液，作为接种家兔用的免疫原，同时也作为试管凝集反应的反应原。动物：体重2 kg以上的雄性健康家兔10只，免疫接种前经检测血清副溶血性弧菌抗体滴度均为阴性。富含SPA的葡萄球菌购自晶美公司。

1.2 副溶血性弧菌多抗血清的制备 采用睾丸内接种法，双侧睾丸各注射0.5 mL同种免疫原。8只家兔分别用经甲醛处理的4株副溶血性弧菌免疫原，2只家兔用经紫外线处理的1株免疫原进行免疫接种，一次接种后，定期采血检测抗体滴度，观察抗体涨消情况，待抗体滴度明显下降后，进行再次睾丸免疫接种，并观测动物的回忆应答。副溶血性弧菌抗血清滴度测定法：血清从1∶20开始用生理盐水做倍比系列稀释，用试管凝集反应检测血清中副溶血性弧菌的抗体滴度，同时附有各反应原与生理盐水对照，观测结果，出现++以上凝集强度的血清最高稀释度为该血清的抗体滴度。

1.3 检测试剂的制备

1.3.1 SPA菌体试剂的制备 将标准菌株接种于葡萄糖-酵母沁膏-酷蛋白胨琼脂培养基上。37℃培养18～24 h，用无菌的0.01 mol/L，pH 7.2 PBS洗下菌苔，制成均匀悬液。3 000 r/min离心20 min，弃上清。用PBS细菌离心沉淀洗涤2次后，混悬于含0.5%甲醛的PBS内，置于室温3 h。用PBS再离心沉淀洗涤3次后，制成10%细菌悬液(W/V)。置80℃水浴中加热20～30 min。用PBS再次离心沉淀洗涤3次后，制成10%SPA菌体试剂，加入0.1%NaN3，4℃保存。

1.3.2 协同凝集试剂的制备 取10%SPA菌体悬液1 mL，加和特异性抗血清0.1 mL，充分混匀，放37℃ 1 h，然后置4℃冰箱内过夜。3 000 r/min离心20 min，吸出上清。用0.01 mol/L，pH 7.2 PBS离心沉淀洗涤2次后，配成1%抗体致敏的SPA试剂，4℃保存。

1.4 协同凝集实验的建立 在洁净的载玻片上加一小滴生理盐水，加入少量待检细菌制成均匀悬液。加一滴特异性抗体致敏的SPA试剂，充分混合，3 min后观察结果。同时作生理盐水对照及用正常兔血清处理的SPA菌体悬液对照。出现肉眼可见的颗粒状凝集，液体变清者(++)为阳性。5 min后仍无凝集现象者为阴性。生理盐水对照及未致敏SPA菌体对照应为阴性，无自凝现象发生。

2 实验结果

2.1 VP多抗的鉴定结果 BTV多抗鉴定浓度为2.75 mg/mL，ELISA效价为104。

2.2 协同凝集实验敏感性检测结果 阳性对照用碱性蛋白胨水倍比稀释至2.0×106cfu/mL时仍出现清晰的凝集颗粒。

2.3 协同凝集实验特异性检测结果 75份其他肠道杆菌标本，其中大肠埃希菌20份，伤寒沙门菌20份，各取少许菌落接种碱性蛋白胨水37℃增菌6 h，隔水煮沸15 min，冷至室温后按上法进行检测，结果均为阴性。

2.4 协同凝集实验稳定性检测结果 将菌体试剂置4℃冰箱1年，其对阳性对照测定的敏感性基本不变。

2.5 协同凝集实验与培养法结果的比较 112份临床标本，培养法阳性64份，协同凝集法检测，62份阳性，1份阴性，另1份出现非特异性凝集。培养法阴性48份，协同凝集法均阴性。与培养法相比较，协同凝集试验的特异性、敏感性、诊断符合率分别为100%、94.2%、97.3%。

3 讨论

本研究从观察睾丸免疫接种后抗体涨消规律入手，探讨此种免疫法快速制备副溶血性弧菌抗血清的可能性，实验结果显示，4株菌分别首次接种的家兔于7～10 d血清抗体滴度达到高峰，与俄国学者在制备伤寒沙门氏抗血清的研究所获得的结果相似。很显然，此法具有操作简易，免疫次数少，节约免疫原，速效等优点，是一个值得推荐的免疫方法。至于睾丸免疫法为何有如此好的结果，其机理有待进一步研究阐明。

除应用甲醛处理的免疫原外，同时还应用了紫外线照射处理的免疫原，以比较二者的免疫效果。曾有学者指出，甲醛处理细菌能破坏其表面的蛋白质构型，损伤免疫

[1]Bewley,Tam,et al.Detection of total and hemolysin-producing V ibrio phrahaem olyticus in shellfish usingmultip lex PCR amp lification of tl,tdh and tr[J].JMicrobiolMeth,1999,36:215-225.

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[3]Iida T,Park KS,Suthienkul O,et al.Close proximity of the tdh,trh and ure genes on chromosome of Vibrio phrahaemolyticus[J].Microbiology,1998,144:2517-2523.

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[5]YamamotoK,HondaT,MiwataniT,etal.Enzyme-labeled oligonucleotide probe for the detection of the genes for thermostable direct hemolysin(TDH)and TDH-related hemolysin(TRH) ofVibrio phrahaem olyticus[J].Can JMicrobiol,1992,38:410-416.

[6]Depaola A,JL Nordstrom,JC Bowers,et al.Seasonal abundance of total and pathogenic V ibrio parahaemolyticus in alabama oysters[J].App l EnvironMicrobiol,2003,69:1521-1526.

Objective To develop a simple and rapid method for detecting Vibrio parahaemolyticus.Methods Staphylococcus aureus Cowan I was coated with anti Vibrio parahaemolyticus polyclonal antibodies and a coagglutination test(COA)detecting Vibrio parahaemolyticus in 112 samples was established.Results The detect limit of COA was 2×106cfu/mL,and the detect time was 5 min.When 112 samples were tested,the diagnostic specificity,sensitivity and accuracy of the test,compared with standard culture methods,were 100%、94.2%、97.3%,respectively.Conclusion This study lays a foundation for establishing simple and less time-consuming Vibrio parahaemolyticus Coagglutination Test kit.

Vibrio parahaemolyticus;Coagglutination test;Detection method

1005-619X(2009)08-0680-03原，而紫外线是作用核酸，不损伤细菌蛋白质，所以细菌的免疫原性较强。本实验的结果中，虽经紫外线处理的副溶血性弧菌获得了较好的免疫效果，但由于所用动物太少，是否优于甲醛处理的免疫原，尚需要做更多的试验比较，方能定论。

2009-04-14)

文章编号：1005-619X(2009)08-0679-02

全军十一五课题(项目编号06MB134)

副溶血性弧菌再次免疫家兔后的抗体主要IgG，SPA具有能与特异性抗体IgG的Fc段结合的特性，结合后抗体的功能区暴露在葡萄球菌表面，仍然保持与相应抗原特异性结合的特性，且以葡萄球菌为载体，可出现肉眼可见的凝集，该法特异、灵敏、简便、快速，尤其适合海上舰艇人员感染的初步检测。但由于本实验所检测的菌株菌种数较少，且无其他致病弧菌做对照，以及对临床标本的处理等问题仍然需要进一步探讨完善。