不同浓度NaCl胁迫下盐芥与拟南芥有机渗透调节物质与抗氧化酶系统的比较

关键词:盐芥;拟南芥;NaCl胁迫;渗透调节物质;抗氧化酶系统

中图分类号:Q949.748.3 文献标识号:A 文章编号:1001-4942(2009)12-0048-04

近年来,研究植物的耐盐机制并筛选抗盐基因用于培育抗盐品种已成为解决因土壤盐渍化造成的农业方面减产问题的重要途径之一。盐芥(Thellungiella halophila),十字花科、盐芥属,野生型为两年生草本,是一种耐盐性强的盐生植物,在我国主要分布于新疆、山东等盐碱土壤区[1]。盐芥形态类似拟南芥,其cDNA 序列与拟南芥也具有高度的同源性(90%~95%),因此,盐芥被提出作为耐盐模式植物[2~5]。近年来对盐芥在生理和分子水平上耐盐机制的研究受到广泛关注,对其抗氧化酶[6,7] 、光合作用色素[8]及渗透与离子胁迫[9~11] 等方面的研究取得了重要进展。

脯氨酸是植物中广泛存在的渗透调节物质,其作用是保持细胞与环境渗透平衡,防止水分散失,在盐胁迫时它能与细胞内的一些化合物形成聚合物,具有保水作用[12]。可溶性蛋白也常作为植物抗逆性指标,主动参与盐胁迫时植物的渗透调节,是除脯氨酸、可溶性糖外,植物中重要的有机渗透调节物质[13] 。植物细胞内存在清除氧自由基的酶促保护系统和非酶促的保护系统,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)是酶促保护系统中的重要组成[14～15]。 McCord和Fridovish 在1969年首先发现了超氧化物歧化酶(SOD),并证明其功能是清除超氧离子(O-•2),提出了氧毒害的超氧自由基假说[16]。此后在植物中不断发现具有同样功能的酶[17]和多种生物自由基及其伤害作用[18],进一步证实了这个假说。目前抗氧化酶系统的各种酶活性已经成为衡量植物抗逆性的最重要指标之一。

本试验测定了不同浓度NaCl胁迫下盐芥和拟南芥中脯氨酸和可溶性蛋白含量以及抗氧化酶SOD、APX、POD、CAT活性,以探讨盐胁迫下两种植物抗盐相关生理指标特征,为研究盐芥的耐盐生理机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 植物的培养与处理

拟南芥,哥伦比亚生态型;盐芥,采自山东东营。种子播种于土+蛭石+珍珠岩(4∶3∶1)的混合土中,用Hoagland营养液每3天浇一次。生长条件:每天光照16 h,黑暗8 h,光照强度为110 μmol/ m²•s,相对湿度为60%/80%(白天/晚上),温度为23℃/18℃(白天/晚上)。生长4周后,采用盐浓度每天递增的方法,对拟南芥和盐芥进行不同浓度NaCl处理,达到最终浓度后再处理1周测定生理指标。每处理重复3次,每重复10~12株苗。对照材料用完全Hoagland营养液浇灌,盐处理材料用NaCl溶液处理,拟南芥NaCl溶液处理浓度为0、 50、100、150、200 mmol/L;盐芥NaCl溶液处理浓度为0、50、100、150、200、 300 mmol/L。

1.2 渗透调节物质测定脯氨酸含量的测定:参照朱广廉[19]的方法略作修改,取0.2 g鲜材料,加5%乙酸1 ml 和水10 ml研磨并过滤,取滤液4 ml,加沸石0.4 g,振荡5 min后3 000 r/min离心10 min,取上清2 ml加冰醋酸2 ml及茚三酮2 ml,振荡5 min后加热1 h,再加入3 ml苯,充分振荡,静置分层,取上层有色部分于515 nm波长下比色。可溶性蛋白的测定:参照邹琦[20]的方法略作修改,取0.5 g叶片加5 ml pH 7.8的磷酸缓冲液冰浴研磨,12 000 r/min、4℃离心20 min,取0.1 ml上清液加0.9 ml去离子水,再加5 ml考马斯亮蓝G-250反应2 min后于595 nm比色。

1.3 抗氧化酶系统酶活性测定

酶提取液制备:取0.5 g叶片加5 ml提取液(pH 7.8的磷酸缓冲液)冰浴研磨,12 000 r/min、4℃离心20 min,上清液即为酶提取液。

反应液的配制:1.940 g Met、0.061 g NBT、0.019 g EDTA-2Na 、0.018825 g核黄素,用pH 7.8的 PBS定容至500 ml。

SOD的测定:参照Dhindsa[21]的方法略作修改,取0.5 ml酶提取液加3 ml反应液在40 μmol/m²•s光强下反应30 min,以不照光的为对照(以pH 7.8 PBS代替酶液,再加反应液调0),用UV-160型分光光度计测定560 nm的OD值。

CAT的测定:参照张志良[22]的方法略作修改,取0.1 ml酶提取液加入2.9 ml反应液(即 30% H₂O₂ 0.28 ml用pH 7.0 磷酸缓冲液定容至250 ml),在240 nm下比色。

APX的测定:参照Asada[23]的方法略作修改,取0.1 ml酶提取液加入2.9 ml反应液(即30% H₂O₂ 55 μl加0.024 g ASA和0.019 g EDTA-2Na,用pH 7.0 PBS定容至500 ml (0/60),在290 nm下比色。

POD的测定:参照Omran[24]的方法略作修改,取30%酶提取液20 μl加入3 ml反应液(即愈创木酚0.125 ml加30% H₂O₂ 0.25 ml,用pH 7.0磷酸缓冲液定容至250 ml(0/60),在470 nm下比色。

2 结果与分析

2.1 不同浓度NaCl处理对盐芥和拟南芥渗透调节物质的影响

试验结果(图1)表明,经不同浓度NaCl处理7天后,拟南芥的脯氨酸和可溶性蛋白含量均高于对照,且随NaCl浓度的升高两者的含量先增加,在100 mmol/L处理时达到最高,之后呈下降趋势。而盐芥随盐浓度升高逐渐积累渗透调节物质,各处理间差异显著。

可见,当NaCl处理浓度高于100 mmol/L时,盐芥较拟南芥可积累更多的渗透调节物质,在150、200 mmol/L处理时,盐芥的脯氨酸含量分别比拟南芥高43%和86%,可溶性蛋白含量分别高53%和120%。

2.2 不同浓度NaCl处理对盐芥和拟南芥抗氧化酶系统的影响

由图2可见,经NaCl处理7天后,盐芥的SOD、POD、CAT、APX活性均高于拟南芥。随NaCl处理浓度的升高,拟南芥的SOD、POD活性均先升高后降低,100 mmol/L处理的活性最高,与其它处理的差异达显著水平;200 mmol/L处理的活性最低,且均显著低于其它处理。NaCl处理的盐芥SOD、POD活性均高于对照,且随NaCl浓度的升高,两者的活性变化趋势与拟南芥相似,均先升后降,并分别以150、200 mmol/L处理的活性最高;但SOD的变化较为平缓。