观赏百合病毒病原形态及内含体研究

梁巧兰　魏列新　徐秉良　师桂英　谢忠魁

摘要：通过带病组织汁液和带病组织超薄切片负染电镜技术对侵染观赏百合的病毒粒子和内含体进行观察，证明在表现不同症状的5个品种中存在球状、短线状、长线状、短杆状4种病毒粒子和晶体状、风轮状、束状、卷筒状、正六边形5种内含体，通过ELISA检测及病毒粒子形态、大小及内含体形态分析，确定球状病毒粒子(直径29.5 nm)为黄瓜花叶病毒，短线状病毒粒子(593.29～639.97 nm×12.15～11.12 nm)为百合无症病毒，长线状病毒粒子(757.58～846.25 nm×12.12～12.75 nm)为马铃薯Y病毒，短杆状病毒粒子(500～807.69 nm×153.85～192.31 nm)为烟草脆裂病毒。

关键词：观赏百合；病毒病原；形态；内含体

中图分类号：S 432．41

百合病毒病是当前百合生产中最主要的病害之一。自sterwart(1896)描述百合坏死条纹以来，相继报道了百合病毒病原14种，类菌原体1种。其中分布广危害严重的是百合无症病毒(Lily symptomlessvirus，LSV)，黄瓜花叶病毒(Cucumber virus,CMV)，郁金香碎锦病毒(Tulip breaking virus，TBV)，百合丛簇病毒(Lily rosette virus，LRV)。病毒侵染后，植株严重矮化，叶片簇生、或卷曲、叶面上出现凸凹不平的泡斑，叶片黄化或呈现花叶状；茎秆扭曲或呈扁平状畸形生长；鳞茎变小，产量下降，严重时减产60％以上，品种变劣，种质明显退化；开花少且小，有时花瓣上出现枯斑或者杂色，有的甚至不能开花，发病严重时整株枯死，严重影响百合观赏价值的发挥，给百合生产造成巨大的经济损失。目前，有关百合病毒病原的研究国内外已有不少报道，但对侵染观赏百合病毒形态的研究，报道较少，为此，本文采用ELISA技术检测了侵染观赏百合的CMV和LSV的发生情况，并通过病汁液负染和病组织超薄切片负染的电镜技术对侵染观赏百合的病毒粒子和内含体的有无及形态进行了观察。

1材料与方法

1．1供试材料

选用采自临洮新兴花卉基地和榆中亚盛花卉基地观赏百合病毒病发生严重，且症状表现不同的观赏百合品种宝佳、西伯利亚、精萃、阿蒂琳娜和热情为试验材料。其中宝佳症状为叶片卷曲，有凸凹不平的泡斑状花叶；西伯利亚为叶脉绿色、叶肉黄化状花叶；精萃为深、浅绿相间的斑驳状花叶；阿蒂琳娜为植株矮化，叶片呈黄绿相间的花叶；热情为扁茎，叶簇生，茎秆扭曲。

1．2 ELISA检测

采用间接ELISA(I-ELISA)和双抗夹心ELISA(DAS-ELISA)两种方法分别对5个观赏百合样品受黄瓜花叶病毒和百合无症病毒侵染情况进行检测；黄瓜花叶病毒(CMV)抗血清及酶标抗体、百合无症病毒(LSV)ELISA检测试剂盒均为美国Agdia公司产品。

1．3病毒粒子形态

1．3．1病毒粒子的负染检测

称取5个观赏百合样品新鲜病叶各1 g，在灭菌冰冻研钵中充分研磨至匀浆，并将匀浆液在4℃下8 000 r／min离心15 min；用毛细滴管吸取上清液滴于附有Formvar膜(聚乙烯醇缩甲醛)的铜网上，稍待片刻，用滤纸片从铜网边缘吸去多余液体；用3％的磷钨酸负染色液染色后，置于JEM-100CX透射电镜下，观察病毒粒子形态，并拍照。

1．3．2组织切片负染观察

取5个观赏百合样品的新鲜病叶组织，经3％戊二醛和1％四氧化锇双固定，乙醇系列脱水后，用Epon812(环氧树脂)包埋，超薄切片经醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后，置于JEM-100CX透射电镜下，观察病组织中的内含体、病毒粒子的有无及其形态，记录并拍照。

2结果与分析

2．1ELISA检测

间接ELISA(I－ELlSA)对5个样晶CMV的检测结果表明：5个观赏百合样品中有2个样品即宝佳和阿蒂琳娜受CMV侵染，经550型酶联免疫测定仪测定各检测孔在490 nm处的OD值，代入临界值(P／N)公式，计算结果为宝佳和阿蒂琳娜的P／N分别为2.61和2.20，大于2，为阳性反应，CMV的检出率为40％(表1)。

DAS-ELISA对5个样品LSV的检测结果表明：除热情外其余4个观赏百合样品均受到LSV的侵染；经550型酶联免疫测定仪测定各检测孔在410 nm处的OD值，代入临界值(P／N)公式，计算结果为宝佳、西伯利亚、精萃、阿蒂琳娜、热情的P／N分别为2.236、3.006、2.290、2.960、1.149，除热情外，其余均大于2，为阳性反应，而且西伯利亚和阿蒂琳娜的P／N值大于阳性对照的P／N，值2.43，LSV的检出率为80％(表2)。

通过ELISA检测结果发现在5个观赏百合样品中存在CMV和LSV复合侵染的现象，复合侵染率为40％。

2．2内含体形态

透射电镜观察到病组织中有正六边形、风轮状、卷筒状、束状和晶体状5种内含体(图1a～e)，不同样品内含体不完全相同。样品宝佳及热情中分别观察到晶体状和正六边形内含体，样品精萃中观察剑轮状、卷筒状、束状3种内含体，而西伯利亚和阿蒂琳娜中没有观察到内含体。

2．3病毒粒子形态

电镜观察结果表明，带病组织中含有4种可观察到的病毒粒子，其形状分别为球状、线状(短)、线状(长)、短杆状，不同样品所含病毒粒子种类不完全相同。其中球状病毒粒子仅在样品宝佳中存在，其直径平均为29.5 nm，超薄切片经醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后，此球状病毒粒子有一个黑色的中心。因黄瓜花叶病毒(CMV)粒子大小29～30 nm，中心有一个12 nm的电子致密中心，另一方面，此样品ELISA检测结果与CMV的ELISA检测结果一致，因此将该球状病毒确定为黄瓜花叶病毒(CMV)(图1f)。线状(短)病毒粒子存在于样品宝佳、西伯利亚、精萃和阿蒂琳娜中，其大小为593.29～639.97 nm×12.15～14.12 nm(图1g)，由于百合无症病毒(LSV)平均大小550～650 nm×12～15 nm，另一方面，此结果与LSV的DAS-ELISA检测结果一致，因此将此线状(短)病毒粒子确定为百合无症病毒。

在观赏百合样品精萃中观察到两种线状病毒粒子，其中一种较短，大小、形态与百合无症病毒粒子相近，而另一种线状病毒粒子较百合无症病毒粒子长，平均大小为757.58～846.25 nm×12.12～12.75 nm(图1h)，同时超薄切片观察到风轮状、带状和卷筒状内含体，这与报道的侵染百合的马铃薯Y病毒的大小以及在寄主体内形成风轮状内含体的结论一致，所以，将这种病毒粒子确定为马铃薯Y

病毒。在观赏百合样品热情中观察到短杆状的病毒粒子，平均大小为500～807.69 nm×153.85～192.31 nm(图li)，以及正六边形内含体，这种短杆状病毒粒子的形态与烟草脆裂病毒相似，而且据报道烟草脆裂病毒在寄主体内可形成正六边形内含体，因此将这种病毒初步确定为烟草脆裂病毒。

2．4不同症状观赏百合叶片中病毒粒子及内含体比较

对不同症状观赏百合叶片中病毒粒子及内含体观察比较结果表明，症状表现为叶片卷曲，有凸凹不平的泡斑状花叶样品宝佳中，存在线状和球状两种病毒粒子，线状病毒粒子较少；症状为叶脉绿色、叶肉黄化状花叶的样品西伯利亚和植株矮化、叶片呈黄绿相间的花叶的阿蒂琳娜中存在线状病毒粒子，其形态和大小与宝佳中观察到的线状病毒一致；两种病毒粒子大小和形态以及ELISA检测结果表明，西伯利亚和阿蒂琳娜受到百合无症病毒的侵染，宝佳同时受到百合无症病毒和黄瓜花叶病毒的复合侵染；在症状为深、浅绿相间的斑驳状花叶的样品精萃中除了上述观察到的无症病毒线状粒子外，还存在一种比这种病毒粒子较长的马铃薯Y病毒线状粒子，由此可见，样品精萃同时受到百合无症病毒和马铃薯Y病毒的共同侵染；在症状表现为扁茎，叶簇生，茎秆扭曲的样品热情则受到烟草脆裂病毒的侵染(表3)。

3结论与讨论

观赏百合病毒病症状类型复杂多样，本研究对症状表现为不同花叶和扁茎、叶簇生、茎秆扭曲的5个观赏百合样品进行了电镜观察，发现侵染甘肃省观赏百合的病毒粒子有球状、短线状、长线状和短杆状4种形态。根据病毒粒子的形态、大小及不同内含体的形态和ELISA检测结果，5个供试观赏百合样品均受到病毒侵染，其中最主要的是cMV和LSV，另外还存在有马铃薯Y病毒和烟草脆裂病毒；有时同一植株受到多种病毒的复合侵染，具有病毒多样性的特点。上述试验结果为我们运用分子生物学技术进行观赏百合病毒种类的分子鉴定奠定了基础。在对病毒的电镜观察研究中，采用了负染色法和超薄切片法两种方法，结合两者的特点，获得更多的信息，如切片负染有利于球状病毒的观察，避免病毒粒子与组织难以区分的问题，而汁液负染则有利于线状病毒的观察，这也就是ELISA检测结果表明在样品宝佳中存在球状病毒和线状病毒复合侵染的现象，在电镜观察中并没有观察到两种病毒存在于同一个视野而两种长、短不同的线状病毒存在于同一视野中的原因。因此，有关观赏百合受多种病毒复合侵染的问题以及表现为其他症状的观赏百合病毒病原、病毒粒子形态以及内含体的有无仍有待于进一步研究。