创伤性脑损伤影响骨折愈合速度的机制

赵小纲　赵光锋　陈毅军　马岳峰　徐少文　江观玉

【摘要】目的探讨创伤性脑损伤影响骨折愈合速度的可能机制。方法采用创伤性脑损伤合并一侧胫骨骨折(A组)制作多发伤模型，不同时点观察FOS、JUN、bFGF、VEGF表达并与B组(单纯一侧胫骨骨折)比较，x线观察骨折愈合情况。结果正常小鼠脑组织FOS、JUN、bFGF、VEGF低水平表达，B组略强。A组脑组织FOS和JUN的表达具有时程的一致性，创伤性脑损伤(TBI)后3 h达到高峰，12 h以后降至对照水平；bFGF与VEGF分别于创伤性脑损伤后12 h、24 h达到高峰，72 h降至对照水平。两组骨折位点FOS、JUN表达均于6 h达峰值，24 h后降至对照水平。3 h、6 h、12 h组间比较差异有显著性。A组骨折位点bFGF、VEGF表达分别于12 h、24 h达峰值，B组于24 h、48 h达峰值，均持续表达96 h以上。Spearman等级相关分析发现，A组脑挫伤灶周围脑组织FOS蛋白与bFGF表达、bFGF与VEGF蛋白表达呈正相关，相关系数分别是0.896、0.832(P＜0.05)；A组骨折位点FOS蛋白与bFGF表达、bFGF与VEGF蛋白表达呈正相关，相关系数分别是0.938、0.945(P＜0.05)；B组骨折位点FOS蛋白与bFGF表达、bFGF与VEGF蛋白表达也呈正相关，相关系数分别是0.833、0.914(P＜0.05)；两组脑组织FOS、JUN蛋白与骨折位点FOS、JUN表达的关系无统计学意义。影像学上A组在术后第三周时已接近全部愈合，B组到第4周时才全部愈合。结论创伤性脑损伤合并长骨骨折是比较理想的多发伤实验动物模型；创伤性脑损伤后骨折位点bFGF、VEGF表达更早更强，促进成骨。

【关键词】创伤性脑损伤；骨折愈合；即刻早期基因；生长因子

在多发伤救治中观察到骨折合并脑外伤患者骨痂过度生长，甚至在肌肉中出现异位骨化，骨折愈合明显加快，但其发生机制尚不清楚。骨折愈合过程中有许多生长因子的参与，这是骨折愈合的基础。创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)时通过何种机制影响生长因子表达水平的改变从而影响骨折愈合速度，值得深入研究。

1材料与方法

1．1实验材料

1．1．1实验动物ICR小鼠118只，购自浙江省医学科学院实验动物中心，体重20 g左右，清洁级，在安静、无强刺激、室温下饲养24 h以上。

1．1．2主要试剂VEGF、bFGF免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，c-los与c-jun癌基因蛋白免疫组化染色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。自备试剂，DAB显色试剂盒等。

1．2动物模型及分组

ICR小鼠随机分为两组：A组TBI合并一侧胫骨骨折；B组单纯一侧胫骨骨折。TBI参照Queen等脑自由落体撞击模型用直径5 mm垫片代替圆锥预置改良制作，小鼠胫骨骨折参照Hiltunen等方法进行，事先以克氏针做髓内固定。分别于造模后1、3、6、12、24、48、72、96 h快速断头处死小鼠各6只，取致伤侧大脑半球固定。同时截取骨折端周围长约1 cm左右骨膜、肌肉组织固定过夜。常规脱水、石蜡包埋、切片备用。正常对照6只。余下动物(A组7只、B组9只)分别于1、2、3、4周时行x线摄片，曝光条件：40 kV，5 mAs，观察骨折愈合情况。

1．3FOS、JUN与bFGF、VEGF检测

SP法检测脑组织与骨折位点FOS、JUN、bFGF、VEGF表达，按免疫组化试剂盒操作步骤进行，DAB显色，苏木素复染。每张切片随机选取10个40×10倍的光镜视野，计数阳性细胞数／100个细胞，取其均值作为该切片的阳性细胞數。

1．4统计学方法

实验数据用均数±标准差(χ±s)或原始数组的百分比来表示，采用SPSS 10.0统计软件进行统计学处理。均值间差异采用多个均数间两两比较的SNK q检验，部分数据行Spearman等级相关分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2．1骨折愈合情况比较

从影像学上观察，A组在1、2、3、4周时的愈合比例分别为0／7、2／7、6／7、7／7，B组分别为0／9、0／8、2／7、7／7。A组骨痂量比B组略显丰富。

2．2脑组织FO$、JUN、bFGF、VEGF蛋白的表达

正常小鼠低水平表达，FOS、JUN阳性表达在神经细胞的胞核上，bFGF、VEGF阳性染色以胞浆为主，呈棕黄色颗粒。

2．2．1脑组织FOS、JUN蛋白的表达A组3 h达到高峰，12 h以后降至对照水平，FOS和JUN的表达具有时程的一致性。统计学分析表明，A组1、3、6 h与对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。该3个时相组间两两比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。B组表达比对照组略强，但差异无统计学意义(P＞0.05)。

2．2．2脑组织bFGF的表达A组12 h染色反应最为强烈，72 h降至对照水平。统计学分析表明，A组1、3、6、12、24、48 h与对照组比较差异具有显著性(P＜0.05)。该6个时相组间两两比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。B组低水平表达，与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

2．2．3脑组织VEGF蛋白的表达A组TBI后24 h达到高峰，72 h降至对照水平。统计学分析表明，A组6、12、24、48 h与对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。该4个时相组间两两比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。B组低水平表达，与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

2．3骨折位点FOS、JUN、bFGF、VEGF的表达

2．3．1FOS和JUN的表达正常小鼠骨膜肌肉组织FOS、JUN蛋白表达轻度阳性。两组骨折位点FOS、JUN表达均表现为：创伤后1～3 h骨折位点开始表达，6 h达峰值，24 h后降至对照水平。统计学分析表明，两组3、6、12 h与对照组比较差异都具有统计学意义(P＜0.05)。该3个时相组间两两比较差异也都具有统计学意义(P＜0.05)。

2．3．2骨折位点bFGF的表达A组创伤后12 h达峰值，B组于24 h达峰值，均持续表达96 h以上。统计学分析表明，A组除1 h、B组除1、3 h外，与对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。3、6、12、48 h四个时相组问两两比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。

2．3．3骨折位点VEGF蛋白的表达A组创伤后24 h达峰值，B组于48 h达峰值，均持续96 h以上。统计学分析表明，A组6 h后、B组12 h后与

对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。6、12、24 h三个时相组问两两比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。

2．4相关性分析

speamlan等级相关分析，发现A组脑挫伤灶周围脑组织FOS蛋白与bFGF表达、bFGF与VEGF蛋白表达呈正相关，相关系数分别是0.896、0.832，P＜0.05；A组骨折位点FOS蛋白与bFGF表达、bFGF与VEGF蛋白表达呈正相关，相关系数分别是0.938、0.945，P＜0.05；B组骨折位点FOS蛋白与bFGF表达、bFGF与VEGF蛋白表达也呈正相关，相关系数分别是0.833、0.914，P＜0.05；两组脑组织FOS、JUN蛋白与骨折位点FOS、JUN表达的关系无统计学相关意义。

3讨论

小鼠TBI后呈昏迷状态，约2～3 h后逐渐复苏，部分有偏瘫，进食量减少。24 h后进食进水基本正常，但啮咬食物明显减少，直至96 h以后仍未完全恢复。用直径5 mm垫片代替圆锥预置，可以有效减少硬脑膜的破裂。大体可见脑挫伤灶较局限，脑组织肿涨明显，内有多个小出血灶。胫骨均为横形或者轻度斜形骨折，髓内针固定的目的是为了消除骨折端异常活动。该模型经改良后已具备以下特点：(1)与临床颅脑创伤合并多发骨折的损伤机制类似或接近；(2)实验的稳定性、可重复性高；(3)致伤能量能够衡量、伤情能够分级；(4)致伤后对动物的神经功能、病理变化及骨折愈合情况等能够进行有效研究和評估；(5)易于操作、经济。

bFGF的合成主要在骨形成的早期。认为bFGF刺激骨愈合主要是由于刺激了未分化问充质干细胞的增殖。VEGF促进内皮细胞增生形成毛细血管参与骨愈合。bFGF与VEGF有明显的时间和浓度关系，bFGF可以直接和间接地调节VEGF的表达，增加内皮细胞的化学趋向性。皮质直接打击可改变即刻早期基因(immediate early genes，IEGs)的表达。真核细胞内广泛存在c-los、c-jun等IEGs，在第二信使的诱导下，表达FOS和JUN等核蛋白。FOS和JUN蛋白通过亮氨酸拉链形成激活蛋白-1(activated protein-l，AP-1)，后者作为转录因子与许多基因的AP-1结合位点结合，影响晚期靶基因的表达。后续基因通过AP-1转录因子激活而表达的蛋白产物，通过直接或间接的作用途径，调节骨系细胞的分化与增殖。bFGF与癌基因c-fos、c-jun之间存在着密切的关系，两者相辅相成，在精密的调控机制下共同作用，调节细胞的生长与分化。

综合本实验的结果分析，TBI后骨折愈合加速的机制可能为：创伤性脑损伤后挫伤灶周围脑组织FOS、JUN蛋白的高表达使挫伤脑组织bFGF的表达显著上升，继而影响VEGF表达水平的增加，从而在组织修复过程中起协同作用；脑外伤后骨折局部VEGF、bFGF表达到达峰时间提前，峰值更高，有利于促进多种细胞趋化、增殖与分化，促进成骨，但具体机制不详。

合并脑外伤而未行有效固定的骨折，由于骨折处存在不同程度的异常活动，刺激骨折周围的骨形态发生蛋白合成、分泌增加，诱导间质细胞向成骨细胞系转化，促进骨痂形成，是临床上脑外伤合并骨折患者手术时发现大量骨痂形成的可能机制之一。在本实验中，小鼠胫骨骨折事先以克氏针做髓内固定，排除机械性因素的影响，仍可发现TBI后骨折位点bFGF、VEGF表达特点的改变，同时影像学也证实TBI后骨折愈合的速度比单纯骨折小鼠快且骨痂量要丰富，因此，创伤性脑损伤后骨折尽可能的早期确切固定可以充分利用其成骨加速机制，促进骨折修复。