ｂｃｌ－ｘｌ基因过表达在脑梗死中的保护作用及细胞色素Ｃ与ｃａｓｐａｓｅ－３的表达研究

王芙蓉　姜永生　刘　艳　肖文伍　张苏明

【摘要】目的观察大脑中动脉栓塞模型转基因小鼠中bcl-xl的过表达对脑缺血后再灌流的保护作用及其机制。方法建立bcl-xl过表达转基因小鼠模型，将该模型小鼠与同种系野生型小鼠同时行线栓永久性阻塞大脑中动脉，在缺血24 h时测其神经功能评分，观察转基因小鼠与野生型小鼠的差别。在缺血后不同时间点分别检测两种小鼠梗死体积及其动态变化、脑组织中bcl-xl的表达量的差异、再灌流时凋亡细胞的数量和分布情况以及脑中细胞色素c及caspase-3的表达量及分布情况。结果转基因小鼠的神经功能评分低于野生型小鼠。在缺血后不同时间点，转基因小鼠的梗死体积小于并且皮质缺血区内的凋亡细胞数明显少于野生型小鼠，且保护作用发生时间早，持续时问较长。梗死前后转基因小鼠的皮质细胞bcl-xl的表达量均明显高于野生型小鼠，且梗死后两种小鼠体内的bcl-xl的表达量均有所增加，但两者之间差异无统计学意义(P＞0.05)。缺血后再灌流后不同时问点，转基因小鼠缺血局部细胞色素c的表达及caspase-3的活化明显低于野生型小鼠。结论在规范化的标准条件下，转基因小鼠中bcl-xl基因的过表达能够降低脑梗死的体积并改善小鼠的神经功能。过表达bcl-xl基因的这种效应可能是通过抑制细胞凋亡而实现的，其机制可能是bcl-xl基因的过表达抑制了细胞色素c的释放及caspase-3的活化。

【关键词】转基因小鼠；脑梗死；bcl-xl基因；细胞色素c；caspase－3

脑梗死是一类发病率和病死率都很高的疾病，目前尚无理想的治疗措施。病理生理机制复杂，包括细胞离子稳态的破坏、胞内钙的增加、兴奋性神经毒性物质及自由基的损伤等。缺血所致的梗死和神经元凋亡密切相关，凋亡神经元的多少决定着梗死面积的最终大小。肖文伍等研究表明，bcl-xl在体外能够抑制神经元的凋亡。基于上述背景，笔者用所建立的过表达bcl-xl基因的转基因小鼠，制作大脑中动脉线栓模型，与野生型小鼠比较其梗死体积及神经功能评分的差异，用TUNEL观察溶栓后不同时间点凋亡细胞的数量及动态分布变化，同时检测了细胞色素c及caSpaSe-3的表达水平，深入研究其机制，以期为脑缺血的基因治疗及细胞生物学治疗新途径的开辟奠定理论基础。

1材料和方法

1．1转基因小鼠的建立、检测及传代

通过显微注射将PstI线性化的表达质粒导入昆明白小鼠受精卵中并移植入假孕鼠受精卵中，产生出子代小鼠。对子代小鼠进行检测，并对检测阳性的小鼠进行繁殖传代。

1．2动物分组

选用12～16周龄的6号小鼠的第四代子代雄性昆明白鼠，均经检测为bcl-xl过表达小鼠，体重均为30－35 g；另取同龄雄性昆明白小鼠(购自同济医学院动物房)作为野生型小鼠。

选取两组动物各18只，在控制其它实验条件下对它们进行线栓，于24 h时观察神经功能评分情况。并分别于6 h、24 h、72 h后杀鼠，TFC染色，观察它们的脑梗死体积。

另选取转基因小鼠及野生型小鼠两组动物各26只，在控制其它实验条件下对它们进行线栓，分别于缺血．再灌流后6 h、24 h、72 h(每组6只)取脑观察，每组同时有假手术组小鼠4只，阴性对照小鼠4只。了解内源性bcl-xl在缺血前后的表达变化。

选取两组动物各32只，用Western-blot方法观察缺血．再灌流后3 h、6 h、12 h及24 h时(每组6只)细胞色素c及caspase．3的表达情况，每组同时有假手术组小鼠4只，阴性对照小鼠4只。

1．3线栓的制备及手术操作

控制好小鼠的品系、体重与线栓规格的匹配以及术后温度等因素，保证小鼠线栓模型有较好的稳定性。

1．4仪器设备

YXK-5G型婴儿培养箱(上海医用恒温设备厂)；TGL-16G离心机(国产)；紫外分光光度计(PhannaciaBioteeh，英国)；显微摄影仪(OLYMPUS，日本)；兔抗bcl-xl抗体(Santa Cruz)，兔抗cytochrome c抗体(PharMingen)兔抗caspase-3抗体(Santa Cruz)，兔抗caspase-3 P17抗体(cell signaling)。

1．5梗死体积的计算

采用HPIAS-1000高清晰度图像处理系统进行图像分析，测量每片的梗死面积和总面积，每层梗死体积为该层梗死面积和层厚的乘积，各层的梗死體积之和即为总的梗死体积。

1．6神经功能评分

在术后24 h采用5分制评分法对小鼠进行评分，评分由本试验以外的同学完成。评分标准：0分表示无神经损伤体征；1分表示不能完全伸直对侧前爪；2分表示向外侧转圈；3分表示向对侧倾倒；4分表示不能自发行走，意识丧失。

1．7数据分析与统计学方法

采用HPIAS-1000高清晰度图像处理系统进行图像分析。参考图谱每张切片观察6个区域，计数2个表达最强高倍镜视野(×400)。实验数据以均数±标准差(χ±s)表示。采用SPSS 12．0 forWindows统计软件处理。假手数组及相邻时间点的比较采用方差分析后q检验；各相应时问点转基因小鼠与野生型小鼠之间的比较均采用方差分析及SNK-q检验。神经功能评分结果采用Ridit分析进行统计处理。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2结果

将线栓后24 h的转基因小鼠及野生型小鼠分别进行神经功能评分结果见图1。用TIC染色并计算其梗死体积，结果见表1。梗死体积在各不同时间点之间的两两比较差异均有统计学意义(P＜0.001)，且各组问的两两比较差异均具有统计学意义(P＜0.05)。转基因小鼠与野生型小鼠中凋亡细胞的分布结果见表2。梗死前转基因小鼠脑组织中bcl-xl蛋白的表达量明显高于野生型小鼠，而在缺血．再灌流后3 h时，两种小鼠bcl-xl的表达量较梗死明显增加(P＜0.05)，且梗死后两种小鼠的bcl-xl的表达量差异具有统计学意义(P＜0.05)，但所增加的表达量差异无统计学意义(P＞0.05)。转基因小鼠与野生型小鼠阻塞大脑中动脉后，于再灌流3、6、12及24 h细胞色素C的比较见图2，caspase-3中P17蛋白与表达的比较见图3，caspase-3的免疫组化见图4。

3讨论

作为bcl-2家族的一员，bcl-xl在局灶性脑缺血中起着重要的神经元保护作用。本实验用转基因的方法使该基因在神经细胞中过表达，实验结果显示出强大的神经元保护功能：在总体水平上，bcl-xl转基因小鼠的脑梗死体积在缺血后24 h时较野生型小鼠降低了30％，转基因小鼠的缺血区中凋亡

细胞数也较野生型小鼠明显减少，与梗死体积的降低结果相一致。Kim等以及Wissner等发现，bcl-xl转基因小鼠具有脑保护作用而bcl-2转基因小鼠没有此作用，bcl-xl在缺血所导致的神经元损伤中起重要作用。本研究结果显示，在线栓后24 h所进行的神经功能评分中，转基因小鼠的神经功能评分明显低于非转基因小鼠。同时在缺血90 min后再灌流3 h时，两种小鼠均可检测到凋亡细胞，与正常组及假手术组比较差异具有统计学意义(P＜0.01)，但转基因小鼠的凋亡细胞明显少于野生型小鼠(P＜0.01)，说明bcl-xl可能在缺血的早期即已开始发挥抗凋亡作用。缺血一再灌流24 h时，两种小鼠的凋亡细胞计数均有明显增加(P＜0.01)，且达到高峰，转基因小鼠仍显示较强的神经保护作用，其凋亡细胞计数均明显低于野生型小鼠(P＜0.01)。在缺血一再灌流后72 h，两种小鼠的凋亡细胞数均有所减少(P＜0.05)。但从总体来看，转基因小鼠的凋亡细胞数一直明显维持于相对较低的水平。笔者推测，这与过表达的bcl-xl的抗凋亡作用有关，但这种作用是通过何种机制来实现的，也是研究的重点。

有资料研究表明，缺血一再灌流后的急性期具有bcl-xl表达的短暂上升，此时转基因小鼠的脑保护作用是否是通过影响内源性bcl-xl的表达而引起?笔者检测了梗死前后转基因小鼠及野生型小鼠脑中的bcl-xl蛋白的表达情况发现，梗死后两种小鼠的bcl-xl的表达量虽都有增加，但所增加的表达量差异无统计学意义(P＞0.05)。笔者因此推测，缺血所诱导的内源性bcl-xl的产生水平在转基因小鼠及野生型小鼠之问差异无统计学意义，转基因小鼠的这种保护作用不是通过调动内源性bcl-xl的产生实现的，而可能是外源过表达的bcl-xl所起的作用。

另外一个问题是在神经元缺血性损伤时，凋亡的机制如何被启动?在非神经系统中，已证实有两种凋亡途径。外源性途径，由死亡受体介导；内源性途径，由线粒体介导。目前的证据证实，在神经元的缺血．再灌流损伤中，两条凋亡途径均被激活。在内源性途径中的一个关键的步骤，就是线粒体释放细胞色素C，释放出来的细胞色素C可以在ATP或dATP存在的情况下，使凋亡蛋白酶沽化因子Apaf-1(apoptotic protease-activating factor-1)发生构象變化而活化，活化的Apaf-1借助N-端的CARD(caspase-recmitment domain)结构域经同源作用于procaspase-9分子中的CARD结构域寡聚化形成apoptosome复合体，促使procaspase-9自身活化，活化的caspase-9激活下游的效应酶如caspase-3，2，7等，切割特定的凋亡底物，诱发细胞凋亡。caspase-9存在于线粒体中并与细胞色素c同时释放。

笔者的实验发现，在转基因小鼠中，细胞色素c的释放水平一直较低，直至再灌流后24 h时，细胞色素c才有较高的表达，但仍明显低于野生型小鼠，而在缺血．再灌流的早期，caspase-3的活化受到了抑制。笔者推测bcl-xl的过表达能够抑制细胞色素c的释放，并在再灌流的早期能够抑制caspase-3的活化。

目前，基因治疗越来越受到人们的广泛关注。动物实验中基因治疗已经证实有很好的效果。由本研究结果笔者想到，若能够通过基因治疗，将bcl-xl基因转移到脑缺血患者体内，则可以达到很好的治疗效果。在人们具有患某种病的危险因素时，即将特定的治疗基因转入患者体内，在正常情况下，这种外源基因保持静止，而一旦一定的致病因素促发了特定的基因，即引起该基因在体内的表达，从而达到预定的治疗目的。这也可能构成一种脑缺血损伤及其他慢性损伤新的防治策略。