脑出血灶周缺氧诱导因子－ｌａ表达与脑水肿的关系

刘庆新　陈金波　朱玉红　张合亮

【摘要】目的研究高血压脑出血患者血肿周围脑组织缺氧诱导因子-la(Hypoxia inducihlefactor 1，HIF-la)的表达与脑水肿形成的关系。方法选择行高血压性脑内血肿清除术治疗的脑出血患者32例，选取手术过程中获得的血肿周围脑组织，采用免疫组织化学技术测定缺氧诱导因子一la及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达。根据头颅cT测量血肿周围脑水肿带的大小，用双盲法对染色结果及脑水肿的体积进行分析。结果出血4 h后，血肿周围脑组织即可见散在HIF-la表达的神经元[(2.8±0.8)个／高倍视野]，24～48 h时达到高峰[(12.5±3.9)个／高倍视野]，48～72 h高表达持续存在[(12.2±1.8)个／高倍视野]；HIF-la的表达与VEGF(r=0.76，t=6.37，P＜0.01)、脑水肿体积(r=0.64，t=4．56，P＜0.01)成正相关性。结论高血压脑出血血肿周围组织HIF-la的表达与脑水肿的形成有关，HIF-la可能通过诱导、调控VEGF的表达促进脑水肿的形成。

【关键词】脑出血；脑水肿；缺氧诱导因子-1a；血管内皮生长因子

研究表明，多种因素参与了脑出血后血肿周围脑水肿的形成，其中血脑屏障结构功能的变化是脑水肿病理变化的重要环节。血管内皮生长因子(VEGF)与血脑屏障结构和功能的维持、脑水肿的形成关系密切，而缺氧诱导因子-la(HIF-la)是氧调控信息传递通路中的重要因子，可诱导、调控VEGF的表达。为了探讨高血压脑出血患者血肿周围脑组织HIF-la的表达与脑水肿形成的关系，笔者利用免疫组织化学技术测定血肿周围组织HIF-la及VEGF的表达，并对其与脑水肿体积进行相关分析。

1资料与方法

1．1病例与组织标本

选自2002年9月至2005年3月住院行高血压性脑内血肿清除术治疗的脑出血患者。入选标准：符合1995年全国第四届脑血管病学术会议制定的高血压脑出血诊断要点，均经脑cr或Mill证实。一侧脑基底节区出血，出血量45～85 ml，年龄35～75岁，发病72 h内住院治疗。根据以上原则，共收集脑出血患者32例(其中男2l例，女11例)，年龄(55.6±10.2)岁，出血量45～85(60.0±9.3)ml，出血时间4～60(27.8±15.2)h。手术均采用非功能区入颅方式，选取手术过程中切除的少许血肿周围脑组织作为研究标本。根据发病到手术时间分为三组：第一组为出血后24 h以内，第二组为脑出血后25～48 h，第三组为脑出血后49～72 h。手术步骤：取外侧裂下方直切口，长约5cm，成骨窗直径为2.5～3.0 cm。星形剪开硬膜，显露颞中回及部分颞上、下回。双极电凝点灼颞中回皮层血管妥善止血，切除部分颞中回皮层，向血肿方向继续吸除部分脑组织至血肿腔，缓慢吸出积血、凝血块。出血量较大，脑组织肿胀明显，中线结构明显移位，患者已脑疝的，将Labbe氏静脉以前颞叶脑组织全部切除，行内减压术。选取手术过程中切除的少量颞中回脑组织，距血肿多为3～4cm左右，不违反伦理道德，所取标本立即浸入4％的多聚甲醛中固定，5 μm厚连续石蜡切片。

1．2免疫组织化学染色

采用兔抗人血管内皮生长因子多克隆抗体和鼠抗人缺氧诱导因子-la多克隆抗体(购自武汉博士德生物有限公司)，分别进行免疫组化染色。阳性细胞的细胞质染色呈棕黄色。

1．3脑水肿大小的测量

所有患者手术前均经脑CT检查，有2名医生根据多田式[体积(ml)=π／6×长(cm)×宽(cm)×层面(cm)]计算病灶体积(包括血肿和周围水肿)及血肿量。血肿周围脑水肿体积(ml)=病灶体积一血肿体积。

1．4统计学方法

采用HPIAS图像分析系统进行图像分析处理，在目镜10倍、物镜20倍下计数5个测试窗阳性细胞数，取平均值。数据以均数±标准差(χ±s)表示。HIF-la表达量与脑水肿体积及VEGF的相关性分析采用直线相关回归分析。应用四川大学华西公共卫生学院卫生统计学教研室的PEMS 3．1 forWindows软件包进行分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2．1 HE染色示神经元形态学变化

出血4～12 h，血管内皮细胞及神经元细胞肿胀，小血管内可见到中性粒细胞靠边和贴壁现象，出血24～72 h可见神经元细胞质嗜酸变性，胞核固缩，血管周围脑组织白细胞浸润明显，见图1。

2．2血肿周围脑组织HIF-1a的表达与脑水肿的关系

脑出血后4 h血肿周围脑组织即可见散在的HIF-la表达，阳性细胞数为(2.8±0.8)个／高倍视野，见图2。HIF-la表达阳性的神经元在脑出血后24～48 h时达到高峰，(12.5±3.9)个／高倍视野，48～72 h高表达持续存在，(12.2±1.8)个／高倍视野。与对应的脑水肿体积进行相关性分析，HIF-la的表达量与脑水肿体积成正相关性(r=0.64，t=4.56，P<0.01)。见表1。

2．3血肿周围组织HIF-la表达与VEGF表达的关系

脑出血后4 h，可见血肿周围已出现散在VEGF表达阳性细胞(图3)，以神经元为主，也可见中性粒细胞和内皮细胞。随着出血时间延长，表达VEGF的血管内皮细胞明显增多。将血肿周围组织HIF-la的表达与VEGF的表达两项指标进行比较，HIF-la表达与VEGF表达呈正相关性(r=0.76，t=6.37，P＜0.01)。见表1。

3讨论

脑出血后一段时间内血肿周围进行性脑水肿，是导致神经功能恶化的一个重要原因。脑出血后脑水肿的机制尚未完全阐明。许多实验研究显示脑出血后早期在血肿周围、相邻部位甚至远隔区域会出现广泛的脑血流下降，但关于血肿周围脑血流量的改变在脑出血后水肿产生中所起的作用，目前临床上尚有争议。

HIF-la是氧调控信息传递通路中的重要因子，对缺氧特别敏感。HIF-la在正常脑组织不表达，低氧状态下，细胞内氧浓度对HIF-la的表达进行着精细的调节。随着氧浓度的降低，表达量呈指数增长，并决定着HIF-la的活性水平，HIF-la在恢复供氧的细胞内，其半衰期小于5 min。因此，测定脑出血血肿周围脑组织HIF-la的表达情况，可以在一定程度上反映血肿周围脑组织缺血缺氧性损害的程度。笔者对脑出血患者血肿周围脑组织研究结果显示，脑出血后血肿周围脑组织出现HIF-la的表达，且HIF-la的表达量与脑水肿的体积成正相关性，提示HIF-la参与了血肿周围脑水肿的形成。这一结果为脑出血早期血肿周围存在缺血缺氧性损害且参与了脑水肿的形成，提供了新的理论依据。

在正常情况下，脑内无VEGF表达，但各种应激反应条件都可诱导VEGF的表达，其中缺血缺氧强烈诱导VEGF在各类细胞中的表达。笔者的研究结果显示在出血灶周围区内，早期表达VEGF的细胞主要为神经元，也可见中性粒细胞和内皮细胞；后期以血管内皮细胞和胶质细胞增多明显。研究已表明，HIF-la表达可诱导、调控VEGF的表达。笔者的研究结果也发现，HIF-la表达与VEGF表达两者之间呈正相关性。提示脑出血后血肿周围区因缺血缺氧刺激神经元、炎性细胞、内皮细胞和胶质细胞等共同表达VEGF。VEGF能显著增加血管通透性，破坏正常脑组织血脑屏障；另一方面，VEGF能特意性作用于内皮细胞，促进血管形成，而新生血管缺乏完善的血脑屏障，导致血浆渗漏引起脑水肿。因此，笔者认为HIF-la可能是通过诱导、调控VEGF的表达而促进脑水肿的形成。

有动物实验研究表明，应用VEGF治疗脑梗死及脊髓损伤，能促进缺血区血管形成、减轻水肿，具有神经保护作用。笔者的研究结果与动物实验结果不符。笔者推测，VEGF发挥的作用可能与VEGF的表达量有关；另外，VEGF在脑出血后的不同阶段可能发挥不同的作用，脑出血早期主要是增加血管通透性，破坏血脑屏障，促进脑水肿，加重脑损伤，急性期后则主要是保护作用，促进脑损伤的愈合，但其具体的作用机制有待于进一步研究。