产CpxP蛋白枯草芽孢杆菌的发酵优化及中试生产

摘 要：为获得产CpxP蛋白枯草芽孢杆菌ZY1液体发酵的最佳条件并制备微生态菌剂，采用单因素试验与响应面实验对ZY1进行发酵工艺优化研究。结果表明：摇瓶发酵培养基最佳碳源、氮源、无机盐分别为淀粉、豆粕、NaCl；最优培养基配方为淀粉2.12 g/L、豆粕5.90 g/L、NaCl 5.21 g/L，活菌数达到9.63×108 CFU/mL，比培养基优化前提高了11.04倍；摇瓶发酵条件最佳初始pH值、温度、转速、接种量分别为7.0、37 ℃、200 r/min、2%，活菌数达1.05×109 CFU/mL，比培养基优化后提高了9.0%；按10%接种量基于5 t发酵罐体系进行菌剂中试生产过程中，ZY1活菌数达到1.05×10¹¹ CFU/mL，比摇瓶优化后提高了100倍；发酵结束时芽孢率达到90%，经喷雾干燥制备出菌剂1 012 kg，成品检测活菌数为8.5×109 CFU/g。研究结果可为进一步开展CpxP蛋白在动物细菌性腹泻病生物防治功能方面的研究提供基础材料。

关键词：蛋白质工程；CpxP蛋白；枯草芽孢杆菌；发酵优化；响应面；中试生产

中图分类号：Q939.9

文献标识码：A"" DOI：10.7535/hbkd.2025yx01011

收稿日期：2024-05-22；修回日期：2024-08-12；责任编辑：张士莹

基金项目：国家药典委员会科研项目（2021Y04）；

河北省自然科学基金生物医药联合基金重点项目（C2020208020）；河北省农业科技成果转化资金项目（202460101030040）

第一作者简介：

董荣荣（1998—），女，河南濮阳人，硕士研究生，主要从事CpxP蛋白在畜禽养殖中细菌性腹泻病防治功能方面的研究。

通信作者：刘浩。E-mail：390051387@qq.com

周晓辉，教授。E-mail：zhouxh2003@aliyun.com

Fermentation optimization and pilot production of

Bacillus subtilis ZY1 producing CpxP

DONG Rongrong" ZHANG Huan" YU Xinran" LIU Hao" ZHOU Xiaohui1

（1.School of Food and Biology， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang， Hebei 050018， China;

2.Department of Asset and Laboratory Management， Hebei University of Science and Technology，

Shijiazhuang， Hebei 050018， China）

Abstract：In order to obtain the optimal conditions for liquid fermentation of Bacillus subtilis ZY1 producing CpxP protein and prepare microecological bactericides， the fermentation process of Bacillus subtilis ZY1 was optimized by single factor test and response surface test. The results show that the optimal carbon source， nitrogen source and inorganic salt of fermentation medium are starch， soybean meal and NaCl， respectively. The optimal medium formulation is starch at 2.12 g/L， soybean meal at 5.90 g/L， and NaCl at 5.21 g/L， with a viable bacteria count of 9.63×108 CFU/mL， which is 11.04 times higher than that before the medium optimization. The optimum initial pH value， temperature， rotation speed and inoculation amount for shake flask fermentation are 7.0， 37 ℃， 200 r/min and 2%， respectively. The viable bacteria number is 1.05×109 CFU/mL， which is 9.0% higher than that of optimized medium. During the pilot production process of the microecological bactericides based on 5 t fermentation tank system with 10% inoculated quantity， the count of viable ZY1bacteria reaches 1.05×10¹¹ CFU/mL， which is 100 times higher than that after shaker optimization. When the spore rate reaches 90% at the end of fermentation， 1 012 kg bactericides are prepared by spray drying， and the count of viable bactericide is 8.5×109 CFU/g. The research results can provide basic materials for further research on the biocontrol function of CpxP protein in animal bacterial diarrhea disease.

Keywords：protein engineering; CpxP protein; Bacillus subtilis; optimization of fermentation; response surface; pilot production

细菌性腹泻病是动物养殖中的常见疾病，对畜牧业造成较大经济损失^[1]。大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌和非伤寒杆菌等革兰氏阴性菌是引起细菌性腹泻的主要致病菌，通过引起肠道微生物菌群失衡，造成消化道代谢紊乱，导致腹泻甚至死亡。抗生素、中草药以及生物制剂等是细菌性腹泻病的常用防治手段^［2-5］。虽然抗生素治疗效果显著，但长期使用会产生多重耐药性，中国农业农村部已于2020年颁布退出所有促生长类药物饲料添加剂（除中药外）在动物源性食品中的使用^[6]。中草药虽然可以调节动物肠道菌群，缓解细菌性腹泻，但存在提取困难、成分复杂等问题^［7-11］。因此，生物防治成为当前防治细菌性腹泻病的研究热点。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，BS）属于芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，具有可分泌抗菌肽、黏蛋白、有机酸等多种活性代谢产物的益生特性，常被用于畜禽及田间病害的生物防治。但BS功效及作用随菌株的不同而异^[12-15]。基于BS菌株不产生内毒素、可稳定表达外源蛋白、抗逆性强和广谱抗性等优点^[15]，并针对以上BS单一菌株功能特异性弱、代谢产物作用机制不明确等问题，本文研究开发了具有协同抗菌作用的ZY1菌株，其既有BS特性，又拥有分泌抑制革兰氏阴性菌抗菌蛋白CpxP的特性。课题组前期对大肠杆菌MG1655标准株系进行了深入研究，发现过度表达CpxP蛋白会显著削弱其游动能力，暗示CpxP在大肠杆菌纤毛形成过程中起到抑制作用，降低了侵染能力与致病性^［16-18］。经过多序列比对和分子生物学分析，结果显示，CpxP在蛋白水平上与志贺氏菌和沙门氏菌具有较高的同源性，可能对治疗革兰氏阴性菌引起的细菌性腹泻病具有普遍适用性。但由于CpxP蛋白稳定性较差、不易保存，因而ZY1的菌体产量偏低，仅为8.0×10⁷ CFU/mL。而微生物蛋白表达水平与合适的发酵条件息息相关，通过优化发酵培养基与发酵条件，可以充分发挥菌株的生产潜能，提高菌体产量，增加蛋白表达量，降低工业化生产成本^[19]。本研究利用枯草芽孢杆菌ZY1作为表达系统分泌CpxP蛋白，通过单因素试验和响应面实验优化发酵培养基及发酵条件^[20]，利用大罐发酵技术制得高纯度高活性固体菌剂。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株

枯草芽孢杆菌ZY 河北科技大学蛋白质工程实验室筛选并保存。

1.1.2 主要试剂

葡萄糖，北京索莱宝科技有限公司提供；蛋白胨、酵母浸粉、糊精、尿素、豆粕、豆饼粉，河北民得富生物技术有限公司提供；蔗糖、淀粉、甘油、尿素、硫酸铵、NaCl、MnSO4、CaCO3、KCl、MgSO4、ZnSO 天津科百奥生物试剂有限公司提供。

1.1.3 仪器与设备

ZHWY-2102C恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司提供；D-1型自动蒸汽灭菌锅，北京发恩科贸有限公司提供；HH-2数显恒温水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司提供；JJ200精密电子天平，常熟双杰测试仪器厂提供；EL204型分析天平，上海民桥精密科学仪器有限公司提供；SW-CJ-2FD型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司提供；SPX-250B-Ⅱ生化培养箱，上海贺德实验设备有限公司提供；100 L、5 t发酵罐，沧州旺发生物技术研究所有限公司提供；LPG离心喷雾干燥机，沧州旺发生物技术研究所有限公司提供。

1.1.4 培养基配方

LB固体培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，氯化钠10 g/L，琼脂15 g/L，pH值为7.0。LB液体培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，氯化钠10 g/L，pH值为7.0。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化

将实验室低温保藏的枯草芽孢杆菌ZY1在LB固体培养基上划线活化菌株，于37 ℃恒温培养箱中过夜培养。挑取固体培养基上的单菌落，接种至装液量100 mL/250 mL的液体培养基中，于180 r/min、37 ℃过夜培养。按2%接种量将种子液接种至装液量100 mL/250 mL的液体培养基中，于180 r/min、37 ℃培养至稳定期。

1.2.2 发酵培养基优化

在培养基中分别选取淀粉、糊精、甘油、葡萄糖、蔗糖作为唯一碳源，确定枯草芽孢杆菌ZY1的最佳碳源；分别选取蛋白胨、豆饼粉、豆粕、尿素、酵母浸粉、硫酸铵作为唯一氮源，确定最佳氮源；分别选取MnSO4、NaCl、CaCO3、KCl、ZnSO4、MgSO4作为不同无机盐种类，确定最佳无机盐；在最佳碳源、氮源、无机盐的基础上对培养基中的其他因素进一步优化。选择淀粉、豆粕、NaCl的添加量均为0～12.5 g/L，考察3个因素对枯草芽孢杆菌ZY1活菌数的影响，实验重复3次，取平均值。发酵条件均为37 ℃、180 r/min、36 h。

1.2.3 响应面实验

根据单因素试验结果，采用Design-Expert 11软件，依据Box-Behnken实验设计原理，选取淀粉（A）、豆粕（B）、NaCl（C）作为自变量，以活菌数（Y）作为响应值，设计3因素3水平的响应面实验进行发酵培养基优化。Box-Behnken实验设计因素与水平见表1。

1.2.4 发酵条件优化

在确定发酵培养基中淀粉为碳源、豆粕为氮源、NaCl为无机盐的基础上，分别对ZY1初始pH值（5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0）、培养温度（28、31、34、37、40、43 ℃）、接种量（1%、2%、3%、4%、5%）、转速（160、180、200、220、240、260、280 r/min）4个发酵条件进行单因素发酵优化试验，发酵时间为36 h，以活菌数为评价指标，实验重复3次，取平均值。

1.2.5 中试生产

以100 L发酵罐为种子罐，50%装液量，采用火圈接种法接种后进行ZY1种子液培养。发酵罐参数设定温度为37 ℃，电机转数初始6 h为120 r/min，随后为150 r/min，罐体压力为0.05 MPa。将培养后的种子液通过调节管路按10%接种量接种至5 t发酵罐中。基于摇瓶优化后的培养基，在5 t发酵罐中添加酵母膏、玉米浆干粉、硫酸锰等物质进行菌剂中试生产，发酵结束后采用LPG离心喷雾干燥机制备菌剂。

1.2.6 数据统计

采用Origin 2018、Design Expert 11.0软件处理数据，用SPSS 26软件ANOVA检验程序进行单因素方差分析，结果以“平均数±标准误差”表示，Plt;0.05为差异显著，Plt;0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 发酵培养基优化

2.1.1 碳源及添加量对发酵的影响

碳源是微生物代谢活动所需能量的主要来源。菌株对碳源的利用情况可以反馈其生长代谢情况，详见图1。由图1 a）可知，当碳源为淀粉时，活菌数最高为

5.80×10⁸ CFU/mL，较培养基优化前提升了6.25倍，与其他碳源相比，均有显著差异（Plt;0.05），因此得出最佳碳源为淀粉。由图1 d）可知，活菌数随淀粉添加量的增加先上升后下降，当添加量为2.5 g/L时，活菌数最高为8.00×10⁸ CFU/mL，与5 g/L添加量时无显著差异，但均显著高于其他添加量时的ZY1活菌数。因此，淀粉最佳添加量为2.5 g/L。

2.1.2 氮源及添加量对发酵的影响

氮源能提供微生物生长所需要的核苷酸、维生素与矿物质元素。图1 b）表明，当氮源为豆粕时，活菌数为6.73×10⁸ CFU/mL，均显著高于其他氮源培养时的活菌数（Plt;0.05）。因此，最佳氮源为豆粕。由图1 e）可知，未添加豆粕时，活菌数为0，说明微生物无氮源不生长。随着豆粕含量的增加，活菌数先增加后下降，添加量为5.0 g/L时，活菌数均显著高于其他添加量（Plt;0.05），达到9.50×10⁸ CFU/mL。因此，豆粕最佳添加量为5.0 g/L。

2.1.3 无机盐种类及添加量对发酵的影响

无机盐作为微生物生长的必要营养物质，参与微生物的各种代谢途径及细胞构成。由图1 c）可知，当无机盐为NaCl时，ZY1菌体产量均显著高于其余组（MgSO4除外）（Plt;0.05）。因此，最佳无机盐为NaCl。由图1 f）可知，添加量为5.0 g/L时，活菌数最大为9.80×10⁸ CFU/mL，与7.5 g/L相比无显著差异，与其他添加量相比均具有显著性（Plt;0.05）。因此，NaCl最佳添加量为5.0 g/L。

2.2 响应面优化分析

在单因素试验基础上，使用Design Expert 11软件中Box-Behnken设计3因素3水平实验。选取淀粉（A）、豆粕（B）、NaCl（C）添加量为自变量，活菌数（Y）为响应值，设计出17种实验方案，测定每组实验条件下ZY1活菌数，Box-Behnken实验设计及结果见表 回归模型方差分析见表3。

应用Design Expert 11软件得到以活菌数为响应值的二元多项回归方程：Y=86.72-1.64A+2.75B+0.96C-0.25AB+0.68AC+0.1BC-5.45A²-3.87B²-5.45C²。回归模型方差分析如表3所示，二次回归模型P=0.000" 差异极显著；失拟项P=0.079" 差异不显著，说明无异常数据，模型建立成功。响应面相关系数（R²）为0.987" 回归方程校正决定系数为0.971" 均大于0.9 说明拟合程度较好，预测值与实际值高度相关，可应用于ZY1发酵活菌数理论预测。此外，方差分析结果显示，A与B对活菌数影响极显著（Plt;0.01），C对活菌数影响显著（Plt;0.05），各因素对活菌数影响程度为B＞A＞C。

为更直观了解2种变量之间的交互作用及各因素交互作用对ZY1活菌数的影响，运用Design Expert 11软件基于二次回归方程模拟绘制影响活菌数的等高线和三维图，结果如图2所示，其中淀粉、豆粕、NaCl 3个因素均存在极值点。对二次多项回归方程求导，获得最佳培养基配方为淀粉质量浓度为2.12 g/L、豆粕质量浓度为5.90 g/L、NaCl质量浓度为5.21 g/L，在此配方下发酵活菌数的预测值最高达9.74×10⁸ CFU/mL。为了验证响应面模型的准确性，在上述最佳培养基配方条件下进行6次平行实验。经发酵实验结果验证，得到ZY1活菌数平均值为9.63×10⁸ CFU/mL，与预测值接近，说明预测结果可信。

2.3 发酵条件优化

2.3.1 初始pH值对发酵的影响

微生物菌株生长受pH值的影响较大。通常情况下，微生物处于自己的耐受pH值时，可以正常生长繁殖，但生长速度及活性会下降。由图3 a）可知，活菌数随pH值的升高先上升后下降，当pH值为7.0时活菌数最多，达到9.80×10⁸ CFU/mL，与pH值为7.5时相比无显著差异，与其他pH值相比均有显著差异（Plt;0.05）。因此，最佳初始pH值为7.0。

2.3.2 培养温度对发酵的影响

微生物在生长繁殖时随环境温度的变化而变化。温度过高或者过低，均会对微生物的生长繁殖产生影响。由图3 b）可知，温度为37 ℃时，活菌数最高为9.83×10⁸ CFU/mL，与其他温度相比均有显著差异（Plt;0.05），且活菌数随温度的升高先增加后减少。因此，最佳培养温度为37 ℃。

2.3.3 接种量对发酵的影响

在发酵过程中，菌种接种量是影响微生物生长速度的重要因素。适宜的接种量可以促进菌种的生长繁殖，提高发酵效率。由图3 c）可知，当接种量为2%时，活菌数为1.02×10⁹ CFU/mL，与3%接种量相比无显著差异。因此，种子液最佳接种量为2%。

2.3.4 转速对发酵的影响

在摇床发酵中，转速通过影响溶液的溶氧对菌株发酵产生影响。由图3 d）可知，当转速为200 r/min时，活菌数最高，达到1.05×10⁹ CFU/mL，与其他转速相比，均有显著差异（Plt;0.05），且活菌数随转速的增加先上升后下降。因此，最佳转速为200 r/min。

2.4 中试生产

对枯草芽孢杆菌ZY1进行5 t中试扩大生产，发酵过程中参数检测结果见图4。由图可知，5 t发酵罐培养时，6～28 h为对数生长期，32 h时活菌数最大为1.05×10¹¹ CFU/mL，比摇瓶优化后提高了100倍。在12～20 h时受菌株快速生长代谢产生的乙酸、丁酸等短链脂肪酸影响，pH值呈现缓慢下降趋势，20 h后pH值稳定上升，可能与菌株代谢活动减弱及芽孢产生有关^[15]。发酵至36 h时，芽孢率约为75%，此时活菌数为1.01×10¹¹ CFU/mL。由于菌株放大生产的可行性及稳定性较好，因而活菌数均达到预期值，发酵罐回凉结束后芽孢率达到90%时，可用于喷雾干燥。改变管路将发酵液转入预混罐，5 t发酵罐中发酵液流入的预混罐中加入30%氢钙，调整预混罐转速为80 r/min，混匀罐内物料，经喷雾干燥可得到1 012 kg制剂。微生物检测参考标准GB/T 26428—2010，经平板活菌计数验证，得到活菌数为8.50×10⁹ CFU/g。文献[21]对枯草芽孢杆菌进行液态发酵培养、鼓风干燥后，所得芽孢产量为4.80×10⁹ CFU/g。与之相比，虽然本文枯草芽孢杆菌的活性较高，但仍可借鉴其干燥方式获得更高的ZY1活性及芽孢数。文献[22]在对枯草芽孢杆菌Y31培养基和固态发酵条件优化后，Y31活菌数达到了2.40×10¹⁰ CFU/g，远高于本文ZY1活性。其原因一是菌株不同，二是发酵方式不同^[23]。

3 结 语

以课题组前期筛选得到的一株产CpxP蛋白的菌株Bacillus subtilis ZY1为出发菌株进行液体发酵优化及中试生产，得出以下结论：1）培养基优化结果为淀粉2.12 g/L、豆粕5.90 g/L、NaCl 5.21 g/L；2）发酵条件优化结果为初始pH值为7.0、温度为37 ℃、接种量为2%、转速为200 r/min；3）5 t发酵罐中试生产过程中菌株ZY1活菌数达到1.05×10¹¹ CFU/mL；4）发酵液经喷雾干燥制备出1 012 kg菌粉，成品检测后得到活菌数为8.50×10⁹ CFU/g。

本文发酵方式与干燥方式的不同可能损失了菌体产量和蛋白产量，因此，未来拟结合固态发酵与鼓风干燥方式提高ZY1的活菌数及芽孢数，为进一步开展CpxP蛋白在动物细菌性腹泻病生物防治功能方面的研究提供优良制剂。

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