宁夏部分地区哺乳期奶犊牛群中腹泻相关病原流行病学调查

摘 要 为了解宁夏地区哺乳期奶犊牛群中腹泻相关病原的流行情况，采用PCR和RT-PCR法对采自宁夏4个地区、18个规模化奶牛场的334份哺乳期犊牛粪便样品分别进行牛轮状病毒（Bovine rotavirus， BRV）、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛诺如病毒（Bovine norovirus， BNoV）、牛纽布病毒、牛星状病毒、牛环曲病毒、牛嵴病毒（Bovine kobuvirus， BKoV）、牛肠道病毒、隐孢子虫、艾美耳球虫、贾第鞭毛虫、K99型大肠杆菌和沙门氏菌14种腹泻相关病原的检测，并对各种病原的流行特点和主要流行病原的遗传进化关系进行分析。结果显示，从宁夏地区哺乳犊牛粪便中共检出13种腹泻相关病原，其中隐孢子虫（38.02%）、BRV（19.76%）、BKoV（18.56%）和BNoV（13.77%）检出率较高，隐孢子虫、BRV和BKoV在腹泻犊牛粪便中的检出率显著高于健康犊牛（Plt;0.05）。单一病原感染类型占比显著高于两种或两种以上病原混合感染的类型（Plt;" 0.05）。在宁夏4个地区、3个季节采集的样品中，隐孢子虫、BRV、BKoV和BNoV检出率相对较高，在1～30日龄犊牛群中隐孢子虫、BRV和BKoV检出率较高，在31～60日龄犊牛中隐孢子虫和BNoV检出率较高，在60日龄以上的哺乳犊牛中BKoV、BEV和隐孢子虫检出率较高。遗传进化分析结果显示，哺乳犊牛感染的隐孢子虫主要为微小隐孢子虫，BRV主要为A型轮状病毒，BKoV主要为B型爱知病毒，BNoV主要为GIII.2型诺如病毒。以上结果表明，隐孢子虫、BRV、BKoV和BNoV是宁夏地区哺乳期奶犊牛群中主要流行的腹泻相关病原，并与犊牛腹泻的发生关系密切。单一病原感染是哺乳期奶犊牛腹泻相关病原感染的主要类型。犊牛感染的病原种类与季节和日龄关系密切。

关键词 哺乳期奶犊牛；犊牛腹泻；病原；流行病学调查

犊牛腹泻是哺乳期犊牛群中的一种常见疾病，引发犊牛腹泻因素众多，其中肠道病原感染（病毒、寄生虫、细菌）是引起犊牛腹泻的最主要原因之一［1］。牛轮状病毒（Bovine rotavirus， BRV）、牛冠状病毒（Bovine coronavirus， BCoV）、牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus， BVDV）、隐孢子虫、球虫、贾第鞭毛虫、大肠杆菌和沙门氏菌等是常见的与犊牛腹泻相关的病原［2-3］。此外，一些新发的肠道病原，如牛诺如病毒（Bovine norovirus， BNoV）、牛纽布病毒（Bovine nebovirus， BNeV）、牛星状病毒（Bovine astrovirus， BAstV）、牛环曲病毒（Bovine torovirus， BToV）、牛嵴病毒（Bovine kobuvirus， BKoV）、牛肠道病毒（Bovine enterovirus， BEV）等在近年来也多有报道［2， 4-6］。

宁夏地区是中国重要的奶牛和肉牛养殖地区之一，犊牛腹泻问题严重影响了当地畜牧业的健康发展。王文佳等［7］、高海慧等［8］、黎玉琼等［9］先后对宁夏地区犊牛群中常见腹泻病原进行调查。结果显示BRV检出率为32.28%～" 43.16%，隐孢子虫检出率为25.20%～40.00%，BRV和隐孢子虫是引起犊牛腹泻的主要病原。但上述研究没有明确区分犊牛的生长阶段，也没有对新发病原进行检测。据报道，哺乳期与断奶后犊牛感染的病原类型和腹泻的发病情况存在较大差异［10］。郭仕辉等［11］于2019年对宁夏地区新生犊牛腹泻相关病原进行调查分析，发现与新生犊牛腹泻相关的病原主要有BRV（19.80%）、BCoV牛冠状病毒（9.43%）、BNoV（12.26%）和隐孢子虫" （6.60%），主要流行病原在30日龄内的犊牛中检出率较高。牛晓昊［12］于2021年对宁夏地区奶牛场进行4种肠道病原检测，发现在0～2月龄犊牛中隐孢子虫检出率最高（35.24%），在3～4月龄犊牛中艾美耳球虫检出率最高" （31.00%）。这表明犊牛群易感病原种类与犊牛日龄相关。目前，关于宁夏地区奶犊牛群中腹泻相关病原的流行病学研究主要还是集中在对BRV、隐孢子虫等几种引起犊牛腹泻常见病原的调查，对于一些新发病原，如BEV、BNeV、BAstV、BToV、BKoV等在犊牛群中的流行情况仍不清楚。

本研究采集宁夏4个主要奶牛养殖市区、18个规模化奶牛养殖场的哺乳期犊牛粪便样品，采用PCR和RT-PCR对采集的样品进行14种与犊牛腹泻相关的病原检测，并对犊牛群中主要流行病原进行遗传进化分析，以期为宁夏地区犊牛腹泻的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2021年7月至2022年7月，从宁夏回族自治区4个主要奶牛养殖区（银川市、吴忠市、石嘴山市、中卫市）的18 个规模化奶牛养殖场内采集334 份哺乳期犊牛粪便样品。其中腹泻样品218 份，正常样品116 份（表1）。银川市样品202 份，石嘴山市29 份，吴忠市78 份，中卫市25份；1～30日龄犊牛样品279 份，31～60 日龄犊牛样品43 份，60 日龄以上犊牛样品12 份；春季（3月-5月）样品133 份；夏季（6月-8月）样品122 份；秋季（9月-11月）样品0 份；冬季（12月-2月）样品79 份。

1.2 引物合成与阳性质粒构建

参照文献报道分别合成检测BRV［13］、BCoV［14］、BVDV［13］、BNoV［14］、BNeV［15］、BAstV［16］、BToV［16］、BKoV［17］、BEV［18］、隐孢子虫（Cryptosporidium spp.）［19］、艾美耳球虫（Eimeria spp.）［20］、贾第鞭毛虫（Giardia spp.）［21］、K99型大肠杆菌（E.coli K99）［22］和沙门氏菌（Salmonella spp.）［23］ 14 种病原的引物（表 2）。以从宁夏大学动物科技学院临床兽医学重点学科实验室保存的阳性样品中所提取的核酸为模板，分别构建14 种病原相应基因的重组阳性质粒，并对构建好的重组阳性质粒进行PCR和测序鉴定。

1.3 样品处理与核酸提取

将每个集粪管中样品分出两份用于DNA和RNA提取，将剩余的样品置于-80 ℃超低温冰箱保存。1份样品按照粪便DNA提取试剂盒（Stool DNA Kit， OMEGA）操作说明提取粪便中DNA，将提取的DNA置于-80 ℃超低温冰箱保存，备用。取1份粪便样品，按1∶4比例加入PBS溶液后漩涡振荡，放入-80 ℃超低温冰箱反复冻融3 次，于4 ℃、5 000 r/min离心10 min，转移800 μL上清至新的1.5 mL无菌无酶离心管中。按照RNA提取试剂盒（RNAiso Plus， Takara）操作说明提取总RNA，将提取的总RNA使用反转录试剂盒（HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit， Vazyme）反转录为cDNA，置于" -80 ℃超低温冰箱保存，备用。

1.4 PCR和PT-PCR检测

以提取的DNA和cDNA为模板，同时设置以无菌ddH2O为模板的阴性对照和以构建的重组阳性质粒为模板的阳性对照，进行PCR和RT-PCR检测。在加入GelRedTM的1%琼脂糖凝胶中电泳检测PCR扩增产物，并通过凝胶成像系统观察。

1.5 主要病原遗传进化分析

分别参照BRV"" VP6基因［13］、BNoV RdRp基因［14］、BKoV 3D基因［17］、隐孢子虫SSU rRNA基因［24］等合成引物（表3），随机选取部分病原检测呈阳性的样品进行PCR扩增，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒（Gel Extraction Kit， OMEGA）对PCR扩增产物进行回收纯化。将回收纯化产物送上海生工生物技术有限公司采用Sanger法进行测序。将测得序列使用DNAstar（DNAstar 7.0）软件进行拼接，在NCBI数据库中进行BLAST比对。使用MEGA X软件中的" Alignment程序进行多序列比对，根据多序列比对结果，采用DNAstar软件中的Megalign程序进行核苷酸序列一致性分析。使用MEGA X软件，采用邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树，步长检验为1 000次。

1.6 统计分析

使用Excel 2019软件对病原检测结果进行统计，采用SPSS软件（IBM SPSS Statistics"" v 25.0）中卡方检验对不同病原检出率及组间差异进行显著性分析，并使用GraphPad Prism（GraphPad Prism 8.0.1）进行绘图。Plt;0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 重组阳性质粒鉴定

分别以14种病原重组阳性质粒为模板进行PCR鉴定，结果表明（图1），均扩增到与预期片段大小一致的目的条带。对重组阳性质粒测序序列进行BLAST比对，结果与预期相符。

2.2 病原检测结果

2.2.1 病原检测结果概览 对采集的334份犊牛粪便样品利用PCR和RT-PCR方法进行14种病原检测，共检测出13种病原，结果表明（表4），除沙门氏菌未检出外，BVDV、BRV、BCoV、BNoV、BNeV、BAstV、BToV、BKoV、BEV、艾美耳球虫、隐孢子虫、贾第鞭毛虫、E.coli K99的平均检出率分别为" 0.60%、19.76%、11.38%、" 13.77%、 0.30%、10.48%、5.69%、18.56%、" 1.20%、" 5.69%、38.02%、" 5.39%、5.69%。在检测的病毒性病原中，BRV检出率最高" （19.76%），BKoV检出率次之（18.56%），BVDV检出率最低（0.60%）；在检测的寄生虫性病原中，隐孢子虫检出率最高（38.02%），贾第鞭毛虫检出率最低（5.39%）；在检测的细菌性病原中，仅检测出E.coli K99" （5.69%）。通过对检出率进行卡方检验发现，隐孢子虫平均检出率显著高于其他12种病原（Plt;0.05）；BRV、BNoV与BKoV之间检出率差异不显著（Pgt;" 0.05），但与其他病原检出率存在显著差异（Plt;0.05）。对正常犊牛粪便样品和腹泻犊牛粪便样品中病原检出率进行卡方检验，结果显示，腹泻犊牛粪便样品中BRV、BKoV和隐孢子虫检出率显著高于正常样品" （Plt;0.05） （图2）。

2.2.2 病原感染类型分析结果 对采集的样品进行病原感染类型统计分析，发现单一病原感染类型占比为42.22%，分别显著高于两种或多种病原混合感染类型（Plt;0.05）（图3）；混合感染类型中两种病原混合感染类型（23.05%）显著高于两种以上病原混合感染类型（Plt;0.05）。单一病原感染类型中，隐孢子虫检出率最高为14.37%，BRV（5.69%）和BNoV（5.69%）次之，BEV检出率最低为0.30%。

2.2.3 不同地区样品病原检测结果 对采集的样品按照不同地区进行病原检出率分析（表5），银川市样品中隐孢子虫（37.62%）、BRV" （21.78%）和BKoV（16.34%）平均检出率较高，BVDV平均检出率最低（0.50%），BNeV和BEV均未检出；吴忠市样品中隐孢子虫（29.49%）、BKoV（23.08%）和BNoV（17.95%）平均检出率较高，BVDV（1.28%）和BNeV（1.28%）平均检出率最低；石嘴山市样品中隐孢子虫（31.03%）、BRV（31.03%）、BKoV" （13.79%）和BNoV" （13.79%）平均检出率较高，BVDV平均检出率最低（0.50%），BVDV、BNeV、BToV、BEV和艾美耳球虫均未检出；中卫市样品中隐孢子虫" （76.00%）、BAstV（28.00%）、BKoV（28.00%）、BRV（24.00%）和艾美耳球虫（24.00%）平均检出率较高，BNoV和BToV平均检出率最低" （4.00%），BVDV、BNeV、BEV和E.coli K99均未检出。

2.2.4 不同季节样品病原检测结果 对采集的样品按照不同季节进行病原检出率分析（表6），在春季采集的样品中，隐孢子虫（32.33%）、BRV（16.54%）、BNoV（15.04%）和BKoV（14.29%）平均检出率较高，BVDV和艾美耳球虫平均检出率最低（0.75%），BNeV和BEV均未检出；在夏季采集的样品中，隐孢子虫（30.33%）、BKoV（20.49%）、BRV（18.85%）和BNoV（18.03%）平均检出率较高，BNeV平均检出率最低（0.82%），BVDV未检出；在冬季采集的样品中，隐孢子虫（59.49%）、BRV（26.58%）、BKoV（22.78%）、BAstV（22.78%）和艾美耳球虫（20.25%）平均检出率较高，BVDV平均检出率最低（1.26%），BNeV、BEV和E coli K99均未检出。

2.2.5 不同日龄样品病原检测结果 对采集的样品按照不同日龄进行病原检出率分析（表7），在1～30日龄段样品中，隐孢子虫（40.14%）、BRV（22.58%）和BKoV（18.28%）平均检出率较高，BVDV平均检出率最低（0.36%），BEV未检出；在31～60日龄段样品中，隐孢子虫（25.58%）和BNoV（20.93%）平均检出率较高，BVDV、艾美耳球虫和贾第鞭毛虫平均检出率最低" （2.33%），BNeV和BEV均未检出；在60日龄以上样品中，BKoV（58.33%）、BEV（33.33%）和隐孢子虫（33.33%）平均检出率较高，BRV、BCoV和贾第鞭毛虫平均检出率最低（8.33%），BVDV、BNoV、BNeV和BAstV均未检出。

2.3 主要病原遗传进化分析结果

2.3.1 BRV遗传进化分析结果 随机选取10份检测结果阳性的样品进行BRV" VP6基因扩增和序列分析。结果显示，10条BRV"" VP6基因核苷酸序列一致性为93.4%～99.9%（图4-A），与GenBank中公布RV-A型核苷酸序列一致性为94.4%～98.1%。BRV"" VP6基因系统发育分析结果显示（图4-B），10条BRV序列均与GenBank中公布的RV-A群聚为同一个大分支，亲缘关系较近；与RV-B群和RV-C群处于不同分支，亲缘关系较远。

2.3.2 BNoV遗传进化分析结果 随机选取6份检测结果阳性的样品进行BNoV RdRp基因扩增和序列分析，结果显示，6条BNoV RdRp基因核苷酸序列一致性为92.6%～99.0%（图5-A），与GeneBank中已公布的NoV GIII.2型核苷酸序列一致性为92.2%～99.1%。BNoV RdRp基因系统发育树结果表明（图5-B），6条BNoV序列均与GeneBank中已公布的NoV GIII.2型聚为同一个大分支，亲缘关系较近；与NoV GI型、NoV GII型、NoV GIII.1型、NoV GIV型、NoV GV型处于不同分支，亲缘关系较远。

2.3.3 BKoV遗传进化分析结果 随机选取8份检测结果阳性的样品进行BKoV 3D基因扩增和序列分析，结果显示，8条BKoV 3D基因核苷酸序列一致性为91.5%～99.6%（图6-A），与GeneBank中已公布的BKoV核苷酸序列一致性为89.3%～98.5%。BKoV 3D基因系统发育树表明（图6-B），8条BKoV序列均与GeneBank中已公布的B型BKoV聚为同一个大支，亲缘关系较近；与PKoV和CaKoV处于不同分支，亲缘关系较远。

2.3.4 隐孢子虫遗传进化分析结果 随机选取6 份检测结果阳性的样品进行隐孢子虫SSU rRNA基因扩增和序列分析，结果显示，6 条隐孢子虫SSU rRNA基因核苷酸序列的一致性为" 99.7%～100%（图7-A），与GeneBank中已公布的C. parvum核苷酸序列一致性分别为85.1%～" 90.8%。隐孢子虫SSU rRNA基因系统发育树表明（图7-B），6条隐孢子虫序列均与GeneBank中已公布的微小隐孢子虫（C. parvum）聚为同一个大分支，亲缘关系较近；与牛隐孢子虫（C. bovis）、安氏隐孢子虫（C. andersoni）和瑞氏隐孢子虫（C. ryanae）处于不同分支，亲缘关系较远。

3 讨 论

3.1 宁夏地区哺乳期奶犊牛群中腹泻相关病原流行特点

通过对采集自宁夏4个奶牛养殖市区、18个规模化奶牛养殖场的哺乳期奶犊牛粪便样品进行14种病原检测，共检出BVDV、BRV、BCoV、BNoV、BNeV、BAstV、BToV、BKoV、BEV、艾美耳球虫、隐孢子虫、贾第鞭毛虫和E.coli K99"" 13种病原。隐孢子虫（38.02%）、BRV" （19.76%）、BNoV（13.77%）和BKoV（18.56%）检出率显著高于其他病原，是哺乳期奶犊牛群中主要流行病原。黎玉琼等［9］在对宁夏地区奶犊牛进行腹泻病原调查中发现，隐孢子虫（40.00%）和BRV（43.16%）在腹泻犊牛中检出率较高，是引起犊牛腹泻的主要病原。本研究中发现隐孢子虫和BRV在腹泻犊牛中检出率显著高于正常犊牛，这说明隐孢子虫和BRV感染与犊牛腹泻发生关系密切。此外，在本研究还发现了BKoV在腹泻样品中检出率显著高于正常犊牛，表明该病原可能也与宁夏地区哺乳期奶犊牛腹泻发生密切相关。BKoV作为一种新发病原，在健康和腹泻牛群中均有发现，在中国多个省份和地区均已有报道，并呈广泛流行趋势［25］。据报道，BKoV在腹泻犊牛中检出率显著高于健康犊牛［25］，这也表明BKoV感染与犊牛腹泻可能密切相关，这与本研究检测结果相一致，但该病原的致病作用还有待进一步研究。通过对样品病原感染类型进行分析发现，宁夏地区哺乳期奶犊牛中病原感染类型呈多样化，但单一病原感染类型占比分别高于两种或两种以上病原的混合感染类型，表明单一病原感染仍然是最主要的感染类型。在黎玉琼等［9］、郭仕辉等［11］研究中也表明宁夏地区犊牛腹泻病原感染类型以单一病原感染为主，这与本研究结果一致。

本研究对不同地区样品的病原检测结果进行分析发现，宁夏地区病原感染种类繁多，但隐孢子虫在4个地区样品中检出率均为最高，其次BRV、BKoV和BNoV在宁夏各地区的检出率也相对较高，表明上述4种病原在宁夏地区哺乳奶犊牛群中广泛存在。牛晓昊［12］对宁夏4个奶牛养殖市区犊牛粪便中的4种肠道病原进行分析，结果表明隐孢子虫感染普遍存在，并且腹泻犊牛样品中隐孢子虫检出率显著高于正常犊牛，这与本研究结果相一致。熊新雪［26］对宁夏地区犊牛腹泻相关病毒调查结果表明，BRV（14.23%）和BKoV（26.02%）在宁夏地区犊牛中检出率较高，在4个奶牛养殖市区均有检出，但未检测出BVDV。而在本研究中，在银川市和吴忠市样品中检测出了BVDV，平均检出率分别为0.50%和1.28%。2019年一项关于中国西部地区牛群中BVDV血清学调查显示，宁夏地区奶牛群中BVDV平均阳性率为30.00%［27］，这表明宁夏地区奶牛群中存在BVDV感染，也提示宁夏地区需要加强对BVDV的检测和防控。

本研究对不同季节样品的病原检测结果进行分析发现，隐孢子虫在春、夏、冬3个季节均有较高的检出率，而BRV和BKoV在冬季检出率较高。BRV、BCoV、BAstV、BNoV、BKoV和隐孢子虫等多种病原在春、夏、冬3个季节哺乳期奶犊牛粪便样品中均有检出，且在1～30日龄犊牛群中检出率较高，表明除BRV、BCoV、隐孢子虫等公认能引起犊牛腹泻的病原流行外，BNoV、BAstV、BKoV等新发病原也已在宁夏地区存在并广泛流行。本研究由于未采集到秋季样品，无法对宁夏地区哺乳期奶犊牛群中腹泻相关病原的全年流行情况进行准确分析，存在一定不足，但对研究宁夏地区犊牛腹泻相关病原的流行也具有重要参考价值。

本研究对不同日龄犊牛样品的病原检测结果进行分析发现，在1～30日龄犊牛中隐孢子虫、BRV和BKoV检出率较高，在31～60日龄犊牛中隐孢子虫和BNoV检出率较高，而在60日龄以上犊牛中BKoV、BEV和隐孢子虫检出率较高。黎玉琼等［9］对宁夏部分地区10个奶牛场" 0～60日龄犊牛进行与犊牛腹泻相关病原的调查发现，BRV和隐孢子虫等检出率较高，为主要病原。郭仕辉等［11］对宁夏部分地区2月龄新生犊牛进行腹泻病原调查发现，BRV、BNoV和隐孢子虫等为新生犊牛腹泻的主要相关病原。上述研究结果也表明犊牛感染的病原种类与犊牛日龄相关。

3.2 宁夏地区哺乳期奶犊牛群中主要流行病原的遗传进化分析

根据RV的" VP6基因可以将RV分为A～H 8个血清型，A型RV是在多种哺乳动物中分布最广泛的血清型［28］。在本研究中，BRV"" VP6基因系统发育分析结果显示，检出的BRV与A型RV聚为一支，遗传距离最近，表明宁夏地区哺乳期奶犊牛群中流行的BRV主要为A型RV。郭仕辉等［11］、熊新雪［26］对宁夏地区奶犊牛群中流行的BRV分析发现，检出的BRV均为A型RV，这表明A型RV为奶犊牛群中的主要感染类型。

根据RdRp基因和VP1衣壳基因可将NoV分为GI～GVII 7个基因型，BNoV为GIII基因型［29］。在本研究中，BNoV RdRp基因系统发育分析结果显示，检出的BNoV与NoV GIII.2型聚为一支，遗传距离最近，表明宁夏地区哺乳期奶犊牛群中流行的NoV为GIII.2型。郭仕辉等［11］、熊新雪［26］对宁夏地区奶犊牛群中流行的病毒分析发现，犊牛群中检出的BNoV均为GIII.2型NoV，这与本研究结果相一致。在Guo等［15］研究中发现，中国地区犊牛群中存在有GIII.1型NoV。王玥琳［30］对河南、四川等地检出的BNoV进行分析发现，大部分为GIII.2型NoV，小部分为GIII.1型NoV。这表明GIII.2型NoV为犊牛群中流行的主要类型，在中国多地已广泛流行，宁夏地区哺乳期犊牛群中主要流行的也为GIII.2型NoV。

KoV属于微RNA病毒科成员，国际病毒委员会将KoV分为A～F 6个种［31］。在本研究中，BKoV 3D基因系统发育分析结果显示，检出的BKoV与GeneBank中已公布的B型爱知病毒BKoV聚为同一分支，遗传距离较近，与C型爱知病毒PKoV和CaKoV处于不同分支，遗传距离较远，表明宁夏地区哺乳期奶犊牛群中流行的BKoV主要为B型爱知病毒。但从系统发育树观察到获得序列较为分散，表明BKoV存在较大的遗传变异性。

隐孢子虫是引起犊牛腹泻的常见病原，能引起犊牛腹泻的有C. parvum、C. bovis、" C.andersoni和C. ryanae等，其中C. parvum最为常见［32］。在本研究中，隐孢子虫SSU rRN基因系统发育分析结果显示，检出的隐孢子虫与" C.parvum聚为一支，遗传距离最近，表明宁夏地区哺乳期奶犊牛群中流行的隐孢子虫类型主要为C. parvum。Li等［33］研究发现，C. parvum感染与犊牛日龄有关，断奶前犊牛C. parvum检出率高于其他虫种。郭仕辉等［11］对宁夏部分地区新生犊牛腹泻病原调查结果显示，C. parvum为新生犊牛群中流行的主要虫种。牛晓昊［12］对宁夏地区不同月龄奶牛进行隐孢子虫检测，发现" C.parvum仅在0～4月龄犊牛群中被检出，为" 0～2月龄犊牛群中流行的优势虫种。以上研究表明，宁夏地区哺乳期奶犊牛群中存在C. parvum的广泛流行。C. parvum是引起新生儿和多种幼龄动物腹泻的重要病原，高致病性C. parvum会对公共卫生造成巨大威胁。宁夏地区哺乳期奶犊牛群中C. parvum的广泛流行提示该地区需要进一步加强对C. parvum的生物安全防控。

4 结" 论

本研究从宁夏地区哺乳期奶犊牛粪便中检出13种腹泻相关的病原，其中隐孢子虫、BRV、BKoV和BNoV是宁夏地区哺乳期奶犊牛群中主要流行的病原，隐孢子虫、BRV和BKoV与奶犊牛腹泻的发生显著相关。单一病原感染仍然是哺乳期奶犊牛腹泻相关病原感染的主要类型。宁夏地区哺乳期奶犊牛感染的隐孢子虫主要为C. parvum，BRV主要为A型RV、BKoV主要为B型爱知病毒、BNoV主要为GIII.2型NoV。本研究明确了宁夏地区哺乳期奶犊牛群中腹泻相关病原的流行情况，为宁夏地区哺乳期奶犊牛群腹泻防控提供了参考依据。

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Epidemiological Investigation of Diarrhea-associated Pathogens in Suckling Dairy Calf Herds in Some Areas of Ningxia

CUI Shengwei1， ZHAO Qingmei2， YU Kun1， XUE Jiaqi1， SUN Ruohan1， LI Yong3，MA Yun1 and YU Yongtao1

（1.School of Animal Science and Technology， Ningxia University， Yinchuan 750021，China;

2.School of Biological Science and Engineering， North Minzu University， Yinchuan 750021，China;

3.School of Life Sciences， Ningxia University， Yinchuan 750021，China）

Abstract

To understand the prevalence of diarrhea-associated pathogens in suckling dairy calves in the Ningxia region， 334 fecal samples from suckling calves were collected from 18 large-scale dairy farms in four regions of Ningxia.The samples were tested for bovine rotavirus （BRV）， bovine coronavirus， bovine viral diarrhea virus， bovine norovirus （BNoV）， bovine nebovirus， bovine astrovirus， bovine torovirus， bovine kobuvirus （BKoV）， bovine enterovirus， Cryptosporidium spp.， Eimeria spp.， Giardia spp.， E. coli K99， and Salmonella spp. through PCR and RT-PCR， respectively. The epidemic characteristics of pathogens and the genetic evolutionary relationship of the main epidemic pathogens were analyzed. The results showed that a total of 13 diarrhea-related pathogens were detected in the feces of suckling calves in Ningxia， among these， cryptosporidium （38.02%）， BRV （19.76%）， BKoV （18.56%） and BNoV （13.77%） were the most commonly observed pathogens. The detection rates of Cryptosporidium spp.， BRV， and BKoV in the diarrhea group were significantly higher than that in the healthy group （Plt;0.05）. The proportion of single pathogen infection was significantly higher than that of two or more mixed pathogens（Plt;0.05）. The samples collected from four regions and three seasons in Ningxia had relatively higher detection rates of Cryptosporidium， BRV， BKoV， and BNoV. The detection rates of Cryptosporidium， BRV， and BNoV were higher in calves aged 1 to 30 days.Meanwhile， the detection rates of Cryptosporidium and BNoV were higher in calves aged 31 to 60 days， and the detection rates of BKoV， BEV， and Cryptosporidium were higher in suckling calves above 60 days. The results of the phylogenetic analysis showed that Cryptosporidium， BRV， BKoV， and BNoV infected suckling calves were mainly Cryptosporidium parvus， BKoV type A， BKoV type B， and BNoV type GIII.2. The above results indicated that Cryptosporidium， BRV， BKoV， and BNoV are the main pathogens associated with diarrhea in suckling calves in Ningxia， and are closely related to the occurrence of diarrhea in calves. Single pathogen infection is the main infection type of diarrhea-related pathogens in suckling calves. The pathogenic species of calves are closely related to season and age.

Key words Suckling dairy calves; Calf diarrhea; Pathogen; Epidemiological investigation

Received "2023-05-24 """Returned 2023-06-13

Foundation item The Key Research and Development Programme of Ningxia Hui Autonomous Region （No. 2021BEF02028， No. 2021BEF01001）; the Natural Science Foundation of Ningxia Hui Autonomous Region （No. 2022AAC03231， No. 2023AAC03051）.

First author CUI Shengwei， male， master student.Research area：animal clinical disease diagnosis and treatment techniques. E-mail：cuishengwei1@126.com

Corresponding"" author YU Yongtao， male， professor.Research area：mechanisms of interaction between gastrointestinal flora and animal diseases. E-mail：yongtao_yu@nxu.edu.cn

（责任编辑：顾玉兰 Responsible editor：GU Yulan）