响应面法优化山楂皮渣总黄酮提取工艺及抗氧化活性研究

【摘" "要】" "目的∶确定超声辅助乙醇提取山楂皮渣总黄酮工艺的最佳条件，并对其抗氧化能力进行分析评价。方法∶以山楂皮渣为原料，山楂皮渣总黄酮得率为指标，应用单因素试验分析料液比、提取时间、乙醇体积分数、超声功率对总黄酮得率的影响，并用响应面法优化总黄酮的提取工艺。结果∶料液比为1：16 g/mL，在450 W超声辅助条件下，用体积分数为 70% 的乙醇提取120 min为最佳工艺条件，此条件下山楂皮渣总黄酮得率可高达62.79 mg/g。结论∶超声辅助条件下，利用响应面法优化乙醇提取山楂皮渣总黄酮的工艺条件合理可靠，并得到了最佳工艺；山楂皮渣总黄酮具有很强的抗氧化能力。

【关键词】" "山楂皮渣；总黄酮；响应面法；超声提取；抗氧化

【Abstract】" " Objective： To optimize ultrasound-assisted ethanol extraction of the total flavonoids from hawthorn pomace and determine the antioxidant capacity of the total flavonoids. Method： Hawthorn pomace is used as the raw material， and the yield of total flavonoids from hawthorn pomace as indicator， single-factor experiments are applied to analyze the effects of solid-liquid ratio， extraction time， ethanol volume fraction， and ultrasonic power on the yield of total flavonoids. The response surface methodology is applied to optimize the extraction process of total flavonoids from hawthorn pomace. Result： The optimal extraction conditions for ultrasound-assisted ethanol extraction of total flavonoids from hawthorn pomace： with a solid-liquid ratio of 1：16 g/mL， under 450 W ultrasonic power， using 70% ethanol for extraction over 120 minutes. Under these conditions， the yield of total flavonoids from hawthorn pomace can reach 62.79 mg/g. Conclusion： Optimization of ultrasonic-assisted ethanol extraction of total flavonoids from hawthorn pomace by response surface methodology is reasonable and reliable， and the best optimization of extraction technology is obtained. The total flavonoids from hawthorn pomace have strong antioxidant capacity.

【Key words】" " "hawthorn pomace; total flavonoids; response surface methodology; ultrasonic extraction; antioxidant

〔中图分类号〕 R284.2" " " " " " " " " "〔文献标识码〕" A

〔文章编号〕 1674 - 3229（2024）04 - 0049 - 07" " " " " " DOI：10.20218/j.cnki.1674-3229.2024.04.007

0" " "引言

山楂是蔷薇科山楂属植物的成熟果实，是我国十分常见的药食两用中药材之一，《本草纲目》中记载，山楂干果最早用于治疗胸痛、疝气、消化不良、产后血瘀和便血等 ［1］。研究表明，山楂果实中富含熊果酸、黄酮类化合物等多种生物活性成分，具有抗氧化、延缓衰老、增强免疫力等功能，在心脑血管相关疾病和癌症的预防与治疗等方面具有重要作用［2-7］。由于山楂中黄酮类化合物含量较高、药理作用效果显著，山楂果实和叶中黄酮类化合物提取工艺、活性分析等成为了研究热点［8-14］，但研究山楂皮渣中黄酮类化合物相关报道很少。

本试验以制作山楂罐头废弃的皮渣为原料，在超声辅助条件下，用乙醇作为溶剂提取山楂皮渣中的总黄酮，并对工艺条件进行优化；分析测定最佳工艺条件下提取的山楂皮渣总黄酮的抗氧化活性，为山楂皮渣再利用提供理论支撑。

1" " "材料与方法

1.1" "试验材料

山楂皮渣：本科学生实验制作罐头剩余的废弃皮渣。

1.2" "仪器与设备

分析天平（FA2004C）：上海越平科学仪器有限公司；分光光度计（721型）：上海菁华科技仪器有限公司；酶标仪（Bio-rad iMark）：美国bio-red公司。

1.3" "试验方法

1.3.1" "山楂皮渣处理

将制作罐头废弃的山楂皮渣烘干至恒重，粉碎，过60目筛子备用。

1.3.2" "标准曲线的制作

参照张巧明等［12］研究方法绘制标准曲线图，得到浓度Y（mg/mL）与吸光度A的回归方程。

1.3.3" "山楂皮渣总黄酮的提取

准确称取1.0 g山楂皮渣原料，一定温度下以料液比、乙醇体积分数、提取时间、超声功率为变量提取山楂皮渣总黄酮， 3000 r/min离心，10 min后取上清液置于50 mL容量瓶中，定容待测。量取1 mL待测液置于25 mL容量瓶中，用相应浓度乙醇溶液进行定容测定吸光度值，根据回归方程计算山楂皮渣总黄酮的质量。

1.3.4" "得率计算

W：山楂皮渣总黄酮得率（mg/g）；C：山楂皮渣总黄酮浓度（mg/mL）；V：粗提液体积（mL）；N：稀释倍数；m：试验原料质量（g）。

1.3.5" "单因素试验

一定温度（50 ℃）下，用60%乙醇溶液在超声功率250 W条件下提取山楂皮渣总黄酮30 min，料液比分别设为 1：5、1：10、1：15、1：20、1：25 时计算黄酮得率；料液比为1：10，用体积分数为60%的乙醇溶液在超声功率250 W条件下分别提取山楂皮渣总黄酮 时间30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，并计算黄酮得率；料液比为 1：10，用体积分数分别为 30%、40%、50%、60%、70% 的乙醇水溶液在 250 W超声条件下提取山楂皮渣总黄酮 30 min，并计算黄酮得率；料液比为1：10，用体积分数为 60% 的乙醇溶液分别在250 W、300 W、350 W、400 W、450 W超声条件下提取山楂皮渣总黄酮30 min，并计算黄酮得率。每个处理重复3次。

1.3.6" "响应面优化试验设计

本试验采用4因素3水平分析法，在单因素试验基础上，以山楂皮渣总黄酮得率为指标，以料液比（A）、提取时间（B）、乙醇浓度（C）、超声功率（D）为影响因子，依据design-expert 8.0设计试验，得到二次多项式回归方程的预测模型，从而优化山楂皮渣总黄酮的超声辅助提取工艺，并找到最佳参数［15-17］。具体试验设计见表1。

1.3.7" "山楂皮渣总黄酮抗氧化能力的测定

在最佳条件下提取山楂皮渣黄酮，方法如1.3.3，并应用（1）式计算黄酮得率。然后利用总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒（FRAP法），以蒸馏水作为空白对照，在595 nm条件下用酶标仪测定其总抗氧化能力，每个点做8个重复。

以浓度为纵坐标，OD值为横坐标，绘制标准曲线，列回归方程。将样品OD值代入回归方程，可得标准品相对浓度。山楂皮渣总黄酮抗氧化能力用所得标准品相对浓度来表示。

2" " "结果与分析

2.1" "单因素试验结果与分析

2.1.1" "料液比对山楂皮渣总黄酮得率的影响

芦丁浓度Y（mg/mL）与吸光度A的回归方程为：Y=1.107 A-0.007 （R2=0.999） （2）

由图1-A可以看出，提取条件相同，山楂皮渣总黄酮得率随着料液比的减小先升高后降低，这是因为溶剂量不断增加过程中，细胞内外物质浓度梯度不断增大，使得细胞内物质更易溶出。当料液比为1：15时，总黄酮得率达最大值，之后溶剂量继续增加，总黄酮得率却下降，可能是乙醇溶剂用量过大时，溶液中其他物质会与黄酮类化合物竞争乙醇溶剂［18］，导致山楂皮渣总黄酮的得率测定值减小。因此，本试验选取最佳料液比为1：15。

2.1.2" "超声辅助提取时间对山楂皮渣总黄酮得率的影响

如图1-B，山楂皮渣总黄酮得率与时间关系曲线呈先升后降趋势。当提取时间为90 min时，山楂皮渣总黄酮得率最高。Fick扩散定律［19］提到：在一定范围内，超声提取时间越长总黄酮得率越高。但是超声时间过长（即超出一定范围）其热效应影响就会愈加显著，这将直接导致溶剂加速挥发及某些热敏感组分降解转化，可能会影响黄酮的稳定性和相对含量［16+20］；另一方面提取时间过长其他杂质溶出量也会增大，这些因素都会导致总黄酮得率降低。因此，本试验选取最佳超声提取时间为90 min。

2.1.3" "乙醇体积分数对山楂皮渣总黄酮得率的影响

如图1-C，山楂皮渣总黄酮得率与乙醇体积分数关系曲线呈先升后降趋势。当乙醇体积分数达60%时总黄酮得率最高，乙醇体积分数继续增加，黄酮得率开始降低，可能是由于较高浓度乙醇加速其他醇溶性物质如蛋白质、儿茶素等的大量溶出，从而影响总黄酮得率的测定［21-23］。因此，本试验选取最佳乙醇体积分数为60%。

2.1.4" "超声功率对山楂皮渣总黄酮得率的影响

如图1-D，随着超声功率的增加，山楂皮渣总黄酮得率也是呈现先升高后降低的趋势，功率达400 W时，总黄酮得率达峰值。由于超声波的机械作用和空化效应的影响，植物细胞壁会被破碎，致使细胞内有效成分更多地溶入到提取剂中［24］，因此，一定功率作用下有利于山楂皮渣总黄酮的提取。但若超声功率过高则某些黄酮成分可能会在超声作用下降解，同时溶剂中其他醇溶性物质增加，将最终影响总黄酮得率的测定。

2.2" " 响应面优化试验结果分析

2.2.1" "数学模型的建立与显著性分析

本试验采用Design-Expert 8.0软件对试验数据（表2）进行分析，得到二次多项式回归模型。

方程（3）中Y为山楂皮渣总黄酮得率预测值，X1、X2、X3、X4分别代表料液比、提取时间、乙醇体积分数、超声功率。

方差分析详见表3，预测模型（P＜0.0001）具有高度显著性，失拟性具有不显著性（P=0.6933＞0.05），R2=0.9551，RAdj2=0.9261，表明方程对试验拟合较好，可以对山楂皮渣总黄酮得率进行很好地分析和预测。回归方程各项方差分析显示， X1、X1X4、X2X3、X12、X32、X42因子对山楂皮渣总黄酮得率影响极显著（P＜0.01），X1X2、X1X3、X2X4因子对山楂皮渣总黄酮得率影响不显著（P＞0.05）。各因子对山楂皮渣总黄酮得率的影响依次为：X1（料液比）＞X3（乙醇体积分数）＞X2（提取时间）＞X4（超声功率）。

2.2.2" "影响山楂皮渣总黄酮得率的各因子间的交互作用分析

据Box-Behnken分析可得到不同因子对山楂皮渣总黄酮得率影响的响应曲面及其等高线图［25-28］。三维立体曲线反映每两个影响因子之间的交互作用，响应面曲线坡度越大，各影响因子对考察指标的影响越大，反之，曲线越平缓，各因子对响应值的影响越小；若等高线为椭圆形则影响因子之间交互作用显著，若等高线为圆形，则各影响因子之间交互作用不显著 ［29-30］。本试验因子之间交互作用极显著的见图 2-A和图2-B，显著的见图2-C。

图 2-A 为当提取时间和乙醇体积分数两个变量取零水平时，超声功率和料液比对山楂皮渣总黄酮得率的影响。从等高线图上看，山楂皮渣总黄酮得率随超声功率和料液比增大而快速升高，二者交互作用十分明显，且二者对黄酮提取是相互促进的作用，故黄酮得率在高液料比和高超声功率的相互作用下升高极显著（P＜0.01）。

图2-B为料液比和超声功率两个变量取零水平时，乙醇体积分数和时间对山楂皮渣总黄酮得率的影响。由图2-B可知，随时间延长且乙醇体积分数升高，山楂皮渣总黄酮得率也较高；而时间长乙醇体积分数较低或时间短乙醇体积分数较高条件下，山楂皮渣总黄酮得率均较低。该图能够直观体现总黄酮得率与提取时间、乙醇体积分数呈二次抛物线关系，且等高线呈椭圆形，说明因子间交互作用极其显著（P＜0.01）。

图2-C为料液比和提取时间两个变量取零水平时，其他变量对山楂皮渣总黄酮得率的影响。由图2-C可知，二者对山楂皮渣总黄酮得率也有比较显著的影响，且乙醇体积分数主效应大于超声功率，二者与黄酮得率呈二次曲线关系。但从等高线图上看，二者的交互作用也比较显著（P＜0.05），但是没有图2-A、图2-B中两因素交互作用明显。

综上数据分析，两因子交互作用于山楂皮渣总黄酮得率强弱顺序为： [X2X3gt;X1X4gt;X3X4]，此结果与方差分析结果一致。

2.2.3" "最佳条件的预测及验证性试验

通过响应面软件分析，在料液比1：16 g/mL，时间120 min，乙醇体积分数70%，超声功率450 W时山楂皮渣黄酮提取效果最佳，在此条件下做3次平行试验，结果为62.79 mg/g，试验验证结果和预测值（62.70 mg/g）十分接近，证明结果可靠，建立的数学模型对山楂皮渣总黄酮提取有实用价值。

2.3" "山楂皮渣总黄酮抗氧化能力测定结果

标准品浓度（mmol/L）与OD值之间的回归方程为：

将测得的OD值代入方程（4）计算得出山楂皮渣总黄酮总抗氧化能力为3.4 mmol/g。

3" " "结论

山楂皮渣中含有丰富的黄酮类化合物，超声辅助条件下，用乙醇作为溶剂提取其中总黄酮的方法效率较高，该工艺最佳提取条件为：在450 W超声条件下，以1：16 g/mL的料液比投入试验材料，用体积分数为70%的乙醇提取120 min，此条件下山楂皮渣总黄酮得率可达62.79 mg/g。

山楂皮渣总黄酮具有很强的抗氧化能力，可以作为食品添加剂延缓脂肪的氧化起到一定的防腐作用，还可以延缓人体机能衰老和防治自由基引发的多种疾病，从而可以用来开发功能食品，制作天然抗氧化剂、化妆品、保健品及医药用品等。本研究既可以为利用山楂皮渣生产黄酮类药物提供理论依据，也可以为进一步深入研究山楂皮渣资源的应用价值提供理论支撑。

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责任编辑" "吕荣荣

［收稿日期］" "2024-07-24

［基金项目］" "廊坊市科技局自筹项目（2023013109）

［作者简介］" "张春丹（1982- ），女，硕士，廊坊师范学院生命科学学院实验师，研究方向：植物生理。

［通信作者］" "尚校兰（1985- ），女，博士，廊坊师范学院生命科学学院教授，研究方向：食品科学。