1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂对木瓜蛋白酶活性和稳定性的提高

【摘" "要】" "木瓜蛋白酶在医药、食品、日化等领域有重要应用，设法提高其活性和稳定性有利于放宽木瓜蛋白酶在工业应用中的条件限制，提高经济效益。制备了1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂，并研究其对木瓜蛋白酶活性和稳定性的影响。结果表明，1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂能够通过提高底物的传质速率和酶活性位点附近结构的灵活性来提高木瓜蛋白酶的活性。利用分子对接分析了1，4-丁二醇/氯化胆碱在木瓜蛋白酶上可能的作用位点，通过圆二色光谱证明这一作用并未造成木瓜蛋白酶二级结构的显著改变。并且将木瓜蛋白酶保存在1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂中能够显著提高其稳定性。当溶解在1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂体系中的木瓜蛋白酶被置于37 ℃或4 ℃下保存8 d后，其酶活分别保持在初始酶活的72.9%和86.1%。

【关键词】" "木瓜蛋白酶；活性；稳定性；1，4-丁二醇/氯化胆碱；低共熔溶剂

【Abstract】" " Papain is widely used in fields such as medicine， food， and daily chemicals. The improvement of papain activity and stability is beneficial to relax the restrictions of papain in industrial applications and improve economic benefits. In this paper， 1，4-butanediol/ choline chloride deep eutectic solvent was prepared， and its influence on papain activity and stability was studied. The results show that 1，4-butanediol/choline chloride deep eutectic solvent can enhance the activity of papain by increasing the mass transfer rate of substrates and enhancing the structural flexibility near enzyme active sites. The possible interaction sites of 1，4-butanediol/choline chloride on papain were analyzed by molecular docking， and circular dichroism spectroscopy showed that the interaction did not cause significant changes in the secondary structure of papain. It is worth mentioning that storing papain in 1，4-butanediol/choline chloride deep eutectic solvent can significantly improve its stability. When papain dissolved in the 1， 4-butanediol/choline chloride eutectic solvent system is stored at 37℃ or 4℃ for 8 days， its enzyme activity remains at 72.9% and 86.1% of the initial enzyme activity respectively.

【Key words】" " " papain; activity; stability; 1，4-butanediol/choline chloride; deep eutectic solvent

〔中图分类号〕 Q556.3" " " " " " " " " "〔文献标识码〕" A " " " " " " "〔文章编号〕 1674 - 3229（2024）04 - 0089 - 05

0" " "引言

木瓜蛋白酶主要来自番木瓜的根、茎、叶和果实，是一种具有三个二硫桥的单链球状半胱氨酸蛋白酶［1］。由于木瓜蛋白酶有很好的蛋白水解作用，因此被广泛应用于食品、医药、日化等多个行业，可用于嫩滑肉质、促进消化、清理创口、治疗癌症、美白祛斑等［2-3］。但是木瓜蛋白酶的本质是蛋白质，在生产、运输、储存和应用的过程中容易受到环境温度、pH等多种因素的影响，在很大程度上限制了木瓜蛋白酶的应用条件和价值。因此设法提高木瓜蛋白酶的活性与稳定性，对于放宽其在工业应用中的条件限制、延长其保存和使用时间具有重要价值。

低共熔溶剂是由Lewis或Brønsted酸和碱组成的多组分混合物，其熔点与其组成成分的熔点相比显著降低，多在常温下呈液态。由于环境友好、成本低廉、制备简单、具有较好的生物相容性，低共熔溶剂已经成为新兴的绿色溶剂，被广泛应用于化学、材料和生物领域［4-6］，近些年低共熔溶剂开始被应用于蛋白质等生物大分子的提取，获得了很好的效果，并被证明对于一些蛋白质的结构具有稳定作用［7］。本文选择了黏性较低的1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂，研究其对木瓜蛋白酶活性和稳定性的影响。通过对比在水系和低共熔溶剂体系中木瓜蛋白酶活性随温度、底物浓度、酶促反应时间和存放时间的变化，探究1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂对木瓜蛋白酶活性和稳定性的影响。利用圆二色光谱研究1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂对木瓜蛋白酶二级结构的影响，通过分子对接，解释其可能的作用机理，为低共熔溶剂应用于提高木瓜蛋白酶的活性和稳定性提供理论依据。

1" " "材料与方法

1.1" "材料与试剂

1，4-丁二醇（≥98%）、氯化胆碱（≥98%）、木瓜蛋白酶购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；酪蛋白（优级纯）购自天津市大茂化学试剂厂；三氯乙酸（分析纯）、磷酸氢二钠（分析纯）、磷酸二氢钠（分析纯）、L-半胱氨酸盐酸盐（分析纯）、乙二胺四乙酸二钠（分析纯）、酪氨酸（分析纯）购自天津市化学试剂供销公司。

1.2" "仪器与设备

紫外-可见光谱仪（UV-2550，日本岛津）；圆二色光谱仪（Chirascan，英国应用光物理公司）；集热式恒温磁力搅拌器（DF-101S，郑州长城科工贸有限公司）；水浴恒温振荡器（THZ-82A，金坛市荣华仪器制造有限公司）；恒温培养振荡器（ZWY-200D，上海智城分析仪器制造有限公司）。

1.3" "实验方法

1.3.1" "低共熔溶剂制备

按照1：1：1的摩尔比称量1，4-丁二醇、氯化胆碱和水，共同放入玻璃螺口瓶中并在80 ℃的油浴锅中加热搅拌，直至成为均一的液体。

1.3.2" "低共熔溶剂含水量对木瓜蛋白酶活性的影响

称取0.2 g木瓜蛋白酶，用溶有乙二胺四乙酸二钠和L-半胱氨酸盐酸盐的0.5 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH=6.5）溶解并定容至250.0 mL的容量瓶中，摇匀后用上述磷酸盐缓冲溶液继续稀释10倍。移取稀释后的木瓜蛋白酶溶液2.50 mL于10.00 mL容量瓶中，分别加入7.00，6.00，5.00，4.00和3.00 mL由1.3.1中制得的低共熔溶剂，并用磷酸盐缓冲溶液定容，得到不同含水量低共熔溶剂溶解的木瓜蛋白酶溶液。低共熔溶剂的含水量分别为30%、40%、50%、60%和70%。检测在不同含水量的低共熔溶剂作用下木瓜蛋白酶的活性。

1.3.3" "1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂对木瓜蛋白酶活性的影响

选择1.3.2中酶活最高的含水量，在pH=6.5、反应温度为70 ℃、反应时间为10 min的条件下，分别检测不同底物浓度（2，4，6，10，14，18 mg/mL）下木瓜蛋白酶的活性。

其他条件保持不变，选择底物浓度为6 mg/mL，分别检测不同反应时间（5，10，20，40，60 min）对应的木瓜蛋白酶活性。

其他条件不变，测定不同反应温度（20，30，40，50，60，70，80 ℃）下反应10 min对应的木瓜蛋白酶活性。

1.3.4" "1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂对木瓜蛋白酶稳定性的影响

将木瓜蛋白酶分成两份，一份直接溶解到含有乙二胺四乙酸二钠和L-半胱氨酸盐酸盐的磷酸盐缓冲溶液中，另一份先溶解到上述缓冲溶液中，然后稀释到1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂中，使两份木瓜蛋白酶溶液的终浓度相同。将上述每份溶液分成两份，分别保存在4 ℃和37 ℃下，在保存不同时间（0，8，16，23，30 d）后测定木瓜蛋白酶活性。

1.3.5" "圆二色光谱

将1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂稀释到磷酸盐缓冲溶液中，获得含有不同浓度低共熔溶剂的溶液，用于稀释溶解在磷酸盐缓冲溶液当中的木瓜蛋白酶，使得木瓜蛋白酶的终浓度为10 μmol/L，1，4-丁二醇/氯化胆碱的终浓度分别为0，10，20，40 mmol/L。利用Chirascan圆二色光谱仪进行圆二色光谱扫描，扫描范围为190-260 nm，光程为1 mm。扫描结束后用Pro-Data软件进行数据处理。

1.3.6" "分子对接

从PDB数据库（www.rcsb.org）下载木瓜蛋白酶的PDB文件（PDB ID：1PPD），删除蛋白结构中已经存在的配体，之后利用AutoDock Vina软件将木瓜蛋白酶作为受体蛋白分别与1，4-丁二醇和氯化胆碱对接［8］，盒子大小为54×44×51 Å。利用PyMOl进行对接结果的分析和可视化。

2" " "结果与分析

2.1" "低共熔溶剂含水量对木瓜蛋白酶活性的影响

1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂中的含水量对于木瓜蛋白酶活性的影响如图1所示。从图中可以看出，随着含水量的升高，木瓜蛋白酶活性呈现先上升后下降的趋势，在含水量60%时达到最高。说明低共熔溶剂的含水量对它与木瓜蛋白酶的相互作用存在影响。由于含水量60%的低共熔溶剂对木瓜蛋白酶活性促进效果最好，因此后续工作中均采用含水量为60%的1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂进行研究。

2.2" "1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂对木瓜蛋白酶活性的影响

2.2.1" "不同底物浓度下低共熔溶剂对酶活的影响

从图2可以看出，底物浓度在2～6 mg/mL之间时木瓜蛋白酶活性迅速升高，到达6 mg/mL时酶活基本达到高峰，此时继续增加底物浓度，酶活维持在较高范围内基本不变。当底物浓度达到10 mg/mL时，木瓜蛋白酶的活性达到最高，此后随着底物浓度继续增大，木瓜蛋白酶活性开始下降。说明在低共熔溶剂体系中，传质速率和催化活性位点的饱和依然是影响木瓜蛋白酶活性的主要因素。与磷酸盐缓冲溶液体系不同的是，当木瓜蛋白酶存在于低共熔溶剂体系中时，在本研究的底物浓度范围（2～18 mg/mL）内，其活性均高于磷酸盐缓冲液体系中的木瓜蛋白酶，在底物浓度为6 mg/mL时，低共熔溶剂体系中的酶活要比磷酸盐缓冲液中高46.14%，说明1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂对于木瓜蛋白酶的活性具有较好的促进效果，除激活木瓜蛋白酶的催化活性外，对于低底物浓度下的传质速率也有较好的促进作用。

2.2.2" "不同反应时间下低共熔溶剂对酶活的影响

由于底物浓度的降低以及酶活性的改变，酶促反应的速率一般随反应时间的延长而逐渐降低。从图3中可以看出，1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂体系中的酶促反应也符合这一特点，并且在不同反应时间下酶活均高于磷酸盐缓冲液中的酶活，说明1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂对于木瓜蛋白酶活性具有促进作用，有利于提高酶催化反应速率。

2.2.3" "不同反应温度下低共熔溶剂对酶活的影响

图4为不同反应温度下1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂对木瓜蛋白酶活性的影响。在20～80 ℃温度范围内，1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂体系中木瓜蛋白酶的活性均高于磷酸盐缓冲液体系，并且随温度升高呈现先上升后下降的趋势。当温度达到70 ℃时酶活最高，说明1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂体系没有改变木瓜蛋白酶的最适温度。此外，在20 ℃下木瓜蛋白酶在1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂体系中的活性比同温度磷酸盐缓冲液中提高了191.58%；最适温度70 ℃下这一增幅为23.99%。因此1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂可用于在较高或较低温度下提高木瓜蛋白酶活性，从而方便其在更宽的应用范围内更好地发挥效用。

2.3" "1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂对木瓜蛋白酶稳定性的影响

本文研究了在4 ℃和37 ℃条件下，木瓜蛋白酶在不同溶液体系中的活性随储存时间的变化。从图5可以看出，无论是4 ℃还是37 ℃，1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂均有利于提高酶活。在37 ℃储存8 d时，磷酸盐缓冲溶液中的酶活已经降低到原来的31.0%，而1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂中保存的木瓜蛋白酶仍然保持了72.9%的相对酶活。甚至在37 ℃下存放30 d后，仍然保留10.4%的酶活。在4 ℃下磷酸盐缓冲溶液中的酶活保持时间相对较长，在存放8 d时相对酶活为初始酶活的56.7%，在23 d左右时下降到10.1%；而1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂中保存的木瓜蛋白酶在存放8 d时依然保持86.1%的酶活，存放23 d后相对酶活为18.2%。由此可以看出，1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂体系能够有效维持木瓜蛋白酶的稳定性，有利于酶的长期储存。

2.4" "1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂对木瓜蛋白酶二级结构的影响

圆二色光谱常被用来分析蛋白质的二级结构。本文将木瓜蛋白酶与不同浓度的1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂混合，扫描其圆二色光谱，从而分析1，4-丁二醇/氯化胆碱对木瓜蛋白酶二级结构的影响。从图6可以看出，10 μmol/L木瓜蛋白酶与10 mmol/L和20 mmol/L1，4-丁二醇/氯化胆碱相互作用，对于其圆二色光谱几乎没有影响，说明木瓜蛋白酶的二级结构在1，4-丁二醇/氯化胆碱中可以保持稳定。而在40 mmol/L 1，4-丁二醇/氯化胆碱的条件下，木瓜蛋白酶的圆二色光谱虽然略有不同，但形状未变，主要由221～222 nm和207～210 nm的负峰以及191 nm左右的正峰构成，这是α-螺旋的主要特征。这些结果说明1，4-丁二醇/氯化胆碱对于木瓜蛋白酶的二级结构几乎没有影响，能够保持其天然构象。

2.5" "1，4-丁二醇和氯化胆碱与木瓜蛋白酶的作用位点

利用分子对接研究1，4-丁二醇/氯化胆碱的两种组分分别与木瓜蛋白酶相互作用的位点，结果如图7所示。从图中可以看出，1，4-丁二醇/氯化胆碱与木瓜蛋白酶的作用位点主要包括THR14、LYS17、LYS174和GLY66四个氨基酸残基。而木瓜蛋白酶的催化活性中心主要由CYS25、HIS159和ASN175组成［9］，可以看到1，4-丁二醇/氯化胆碱的作用位点非常接近木瓜蛋白酶的催化位点。因此推测主要是由于1，4-丁二醇/氯化胆碱作用于木瓜蛋白酶的活性位点附近，使其附近的结构更加灵活，从而有利于酶促反应的进行。

3" " "结论

本研究制备了1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂，并且研究了1，4-丁二醇/氯化胆碱对木瓜蛋白酶活性和稳定性的影响。通过实验证明，1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂在不同底物浓度、反应时间和反应温度下均对木瓜蛋白酶活性有提高作用，并且在20 ℃下对木瓜蛋白酶活性的提高幅度达到191.58%，在最适温度70 ℃下这一增幅为23.99%，有利于拓宽木瓜蛋白酶的应用条件。此外，木瓜蛋白酶的稳定性在1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂体系中得到了极大的改善，在37 ℃和4 ℃保存8 d后酶活仍可保留初始酶活的72.9%和86.1%。说明1，4-丁二醇/氯化胆碱低共熔溶剂能够大大延长木瓜蛋白酶在溶液中的保存时间。这一作用主要是因为1，4-丁二醇/氯化胆碱作用在木瓜蛋白酶的催化活性位点附近，使其结构更加灵活，从而有利于酶促反应进行，同时通过圆二色光谱证明这一作用并未对酶的二级结构造成显著影响，木瓜蛋白酶的活性结构基本维持不变。

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［9］ 李有花. 木瓜蛋白酶的定向固定化研究［D］. 无锡：江南大学， 2021.

责任编辑" "孙" "涧

［收稿日期］" "2024-04-03

［基金项目］" "河北省大学生创新创业训练计划项目（S202210100007）

［作者简介］" "王春晖（2001- ），男，廊坊师范学院化学与材料科学学院学生，研究方向：小分子与蛋白质相互作用。

［通信作者］" "郭菁菁（1989- ），女，博士，廊坊师范学院化学与材料科学学院副教授，研究方向：小分子与蛋白质相互作用。