超高效液相色谱-串联质谱测定保健食品中西地那非的不确定度评估

【摘" "要】" "基于超高效液相色谱-串联质谱法（Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）对保健食品中西地那非添加量进行了不确定度评估。通过对样品量取、标准物质溶液的配制、标准曲线拟合、样品稀释定容、重复性测量等实验过程中引入的不确定度进行评定和分析，计算得到在保健食品中的西地那非的总量为0.7878 mg/L 时，扩展不确定度为0.0795 mg/L，包含因子k为2。引起测量不确定度的因素主要是标准物质溶液的配制（相对标准不确定度为0.0433）、最小二乘法拟合标准工作曲线（相对标准不确定度为0.0226），其次为样品的量取、定容、稀释以及测量重复性。该评估模型可为采用UPLC-MS/MS测定西地那非的不确定度评定提供参考。

【关键词】" "不确定度；超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）；西地那非；保健食品；外标法

【Abstract】" " In this study， the uncertainty of sildenafil addition in functional foods was evaluated based on Ultra-high Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry （UPLC-MS/MS）. By evaluating and analyzing the uncertainty introduced in the experimental process of sample measurement， standard material solution preparation， standard curve fitting， sample dilution and volume determination， and repeatability measurement， the expanded uncertainty was 0.0795 mg/L and the coverage factor k was 2 when the total amount of sildenafil in functional food was 0.7878 mg/L. The measurement uncertainty was mainly caused by the preparation of standard solution preparation （urel（C）=0.0433） and the least square fitting standard working curve （urel（ y ）= 0.023）， then by the sample weighing，dilution and detection. The evaluation system could be used to provide a reference for the uncertainty evaluation of the determination of sildenafil in functional food by UPLC-MS/MS.

【Key words】" nbsp; "uncertainty; Ultra-high Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry （UPLC-MS/MS）; sildenafil; functional food; external standard method

〔中图分类号〕" O657.63" "" " " "〔文献标识码〕" A" " " " "〔文章编号〕 1674 - 3229（2024）04 - 0082 - 07

0" " "引言

随着国民经济水平的提升，人们的健康意识显著增强，对健康产品的需求不断升级。《国民营养计划（2017-2030年）》明确了“着力发展保健食品”的国家战略布局，对深化保健食品管理提出新的要求［1-2］。保健食品具有特定的保健功能，但并非药品，其发挥作用的方式与药物不同，不具备治疗疾病的功能［3-4］。研究报道，在所有保健品种类中，增强免疫力和缓解疲劳类的保健食品占了很大比例［5］。因此，该类保健品具有巨大的市场，更成为非法添加的重灾区，其中最常见的是那非类物质的添加［6-9］。西地那非作为处方药，具有松弛平滑肌、扩张血管、改善性功能的功效，但需要在医生指导下服用，如果滥用会出现恶心、头晕，严重时可造成心肌梗死［10］。国家明文规定严禁在保健食品中添加西地那非，但近年来我国查处的保健食品中非法添加西地那非的案例屡见不鲜［11-12］。市场监督管理部门高度重视这一现象，针对该类保健食品陆续发布补充检测方法以及检测项目批准件。

自2006年开始，国家监管部门发布的西地那非补充检测方法主要有高效液相色谱法［13-15］、高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）［16-17］以及超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）［18-19］，检测的样品涉及酒类、保健食品、功能饮料等。液质联用方法的出现，显著提高了西地那非检出的灵敏度和准确性。2009年之后发布的检测方法都采用了液质联用的方法，液质联用方法的不确定评估模型已被广泛建立［20-23］。在2018年7月发布的最新方法中，特别提出利用UPLC-MS/MS，UPLC的速度、灵敏度以及分离度远高于HPLC［24-25］，但UPLC-MS/MS应用在西地那非检测的不确定度评估尚无报道。

本研究参考BJS201805《食品中那非类物质的测定》中的方法一，通过UPLC-MS/MS对样品进行定性和定量分析［26］。依据CNAS-RB/T 030-2020 《化学分析中不确定度的评估指南》［27］、GB/T 27418-2017《测量不确定度评定与表示》［28］等文件，对结果的不确定度进行评价，并且评估各个不确定度分量，查找影响UPLC-MS/MS检测食品中西地那非不确定度的因素，最终确定检测结果的置信区间和置信水平，为检测过程的质量控制提供依据。

1" " "材料与方法

1.1" "材料与仪器

保健酒（能力验证品）" "大连海关技术中心；

西地那非柠檬酸盐标准品" "天津阿尔塔生物科技有限公司；

甲醇（色谱纯）" " 德国Merck公司；

甲酸（质谱纯）" " 上海TCI公司；

实验用水 符合国际GB/T 6682-2008的一级水。

Waters Xevo TQD型超高效液相色谱-串联质谱仪" 美国沃特世科技有限公司；

旋涡混合器" 美国赛默飞世尔科技有限公司；

微量移液器" 美国RAININ公司。

1.2" "实验方法

参考《食品中那非类物质的测定》方法一：超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法中的样品前处理与检测方法［26］。

1.2.1" "标准溶液配制

准确量取西地那非柠檬酸盐标准品溶液（西地那非质量浓度为1 mg/mL）10 μL 配制成10 μg/mL的标准储备液；接着吸取10 μg/mL的标准储备液10 μL，配制成1 μg/mL的标准储备液，以上储备液置于4 ℃冰箱储存备用。分别吸取1 μg/mL的标准储备液，配制成浓度为2、5、10、20、50 ng/mL 标准工作溶液。

1.2.2" "样品前处理

取试样适量，摇匀，用微量移液器吸取1 mL样品置于50 mL容量瓶中，补充适量甲醇并进行超声处理15 min，待样品降至室温，用甲醇补足至50 mL，处理后的样品经过微孔滤膜过滤，取续滤液，利用甲醇水溶液（体积比为1：1）稀释续滤液至适当浓度，备用。

1.2.3" 仪器条件

1.2.3.1" 液相色谱条件 色谱柱：Waters CORTECS T3（2.1×100 mm，1.8 μm）；柱温35 ℃；进样量5 μL；流动相A为体积分数0.1%的甲酸水溶液，B为甲醇；流速为0.3 mL/min。梯度洗脱程序见表1。

1.3" "数学模型

根据食品中那非类物质的测定方法，分析物西地那非的含量计算公式如下：

式中：X表示试样中待测组分的含量，单位为毫克每升（mg/L）；[ρ]表示由标准曲线得到的样品溶液中待测组分的含量，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V表示样品溶液定容体积，单位为毫升（mL）；Vm表示样品取样量，单位为升（L）；f为稀释倍数。

2" " "结果与分析

2.1" "不确定度主要来源

上述方法测定保健食品中的西地那非可能引入的不确定度包括：样品称量和定容、标准溶液的配制过程、标准曲线拟合、仪器重复测定等因素，详细来源见图1。

2.2" "样品称量过程的标准不确定度

样品量取体积为1.0 mL，由1000 μL可调式移液枪引入的标准不确定度包括两个部分：第一，移液枪体积的不确定度，按照JJG 646-2006《移液器计量检定规程》规定［29］ ，1000 μL移液枪移取1000 μL液体的允许误差为±10.0 μL，按均匀分布k=[3]换算成标准偏差为[103]=5.77，则一次称量过程引入的相对标准不确定度为：

第二，移取溶液体积的变动性，可通过重复移取进行统计，重复6次，得到标准偏差为5 uL，则移取溶液体积的相对标准不确定度为：

故，两个分量合成的标准不确定度为

2.3" "样品定容过程中引入的不确定度

样品稀释过程中使用玻璃器均为A级，样品定容和稀释过程中使用50 mL容量瓶，根据JJG196-2006《常用玻璃量器检定规程》［30］规定的偏差要求，A级单标线50 mL容量瓶的容量允许差为±0.05 mL，按均匀分布换算成相对标准不确定度为：

容量瓶校准在20 ℃进行，环境温度一般波动范围控制在 ±5 ℃，在20 ℃下，甲醇和玻璃的体积膨胀系数分别为1.2×10-3，2.5×10-5 ℃ -1，按均匀分布k＝[3]，则试验温度引入的相对标准不确定度为：

则样品溶液稀释过程引入的标准不确定度为：

2.4" "标准溶液配制的不确定度

2.4.1" 西地那非柠檬酸盐溶液引入的不确定度

西地那非柠檬酸盐标准品溶液由天津阿尔塔科技有限公司提供，纯度为99.5%，标准证书给出的扩展不确定度为±5%，包含因子k=2，则引入的相对标准不确定度为：

2.4.2" "配制西地那非标准溶液引入的不确定度

2.4.2.1" "配制100 μg/mL的标准储备液的不确定度

使用10 mL 容量瓶配制储备液，其不确定度包括两部分：第一，容量瓶体积的不确定度，按JJG196-2006《常用玻璃量器检定规程》［30］，A级单标线10 mL容量瓶的容量允许差为±0.02 mL，按均匀分布k=[3]，容量瓶体积引入的不确定度为：

第二，移液枪体积的不确定度，按照JJG 646-2006《移液器计量检定规程》规定［29］，1000 μL移液枪移取1000 μL容量的允许误差为±10.0 μL，按均匀分布k=[3]换算成标准偏差为[103]=5.77，则一次称量过程引入的相对标准不确定度urel（Vp1）为0.0058 。

故配制100 μg/mL 储备液引入的不确定度为：

2.4.2.2" "配制1 μg/mL的标准储备液的不确定度

使用10 mL 容量瓶配制储备液，其不确定度包括两部分：第一，10 mL容量瓶体积的不确定度urel（Vf2）为0.0012。

第二，200 μL移液枪移取100 μL容量的允许误差为±2.0 μL，按均匀分布k=[3]，则一次移取过程引入的相对标准不确定度为：

故配制1 μg/mL储备液引入的不确定度为：

2.4.2.3" "配制2 ng/mL的标准储备液的不确定度

其不确定度包括两部分：第一，容量瓶体积的不确定度，按JJG196-2006《常用玻璃量器检定规程》［30］，A级单标线10 mL容量瓶的容量允许差为±0.02 mL，按均匀分布k＝[3]，容量瓶体积引入的不确定度urel（Vf2）为0.0012。

第二，20 μL移液枪移取20 μL容量的允许误差为±0.8 μL，按均匀分布k=[3]，则一次移取过程引入的相对标准不确定度为：

故配制2 μg/L的标准工作溶液引入的不确定度为：

2.4.2.4" "配制5 ng/mL的标准储备液的不确定度

使用10 mL 容量瓶配制储备液，其不确定度包括两部分：第一，10 mL容量瓶体积引入的不确定度urel（Vf2）为0.0012。

第二，200 μL移液枪移取50 μL容量的允许误差为±1.5 μL，按均匀分布k=[3]，则一次移取过程引入的相对标准不确定度为：

故配制5 ng/mL储备液引入的不确定度为：

2.4.2.5" "配制10 ng/mL标准溶液引入的不确定度

使用10mL 容量瓶配制储备液，其不确定度包括两部分：第一，10 mL容量瓶体积引入的不确定度urel（Vf2）为0.0012。

第二，200 μL移液枪移取100 μL容量的允许误差为±2 μL，按均匀分布k=[3]，则一次移取过程引入的相对标准不确定度为：

故配制10 ng/mL标准工作液引入的相对不确定度为：

2.4.2.6" "配制20 ng/mL标准溶液引入的不确定度

使用10 mL 容量瓶配制储备液，其不确定度包括两部分：第一，10 mL容量瓶体积引入的不确定度urel（Vf2）为0.0012。

第二，200 μL移液枪移取200 μL容量的允许误差为±3.0 μL，按均匀分布k=[3]，则一次移取过程引入的相对标准不确定度为：

故配制20 ng/mL标准工作溶液引入的不确定度为：

2.4.2.7" "配制50 ng/mL标准溶液引入的不确定度

使用10 mL 容量瓶配制储备液，其不确定度包括两部分：第一，10 mL容量瓶体积引入的不确定度urel（Vf2）为0.0012。

第二，1000 μL移液枪移取500 μL容量的允许误差为±5 μL，按均匀分布换算成标准偏差为：

故配制50 ng/mL标准工作溶液引入的不确定度为：

2.4.2.8" "配制标准曲线引入的不确定度

2.5" "标准工作曲线拟合引入的不确定度

由于超高液相色谱-串联质谱仪具有较高的灵敏度，不考虑进样量及仪器示值误差，仪器稳定性是造成所测样品峰面积不确定度的主要原因。因此对5个不同浓度的标准工作溶液分别重复测定3次，样品重复测定6次，所得结果见表3。标准工作曲线回归方程为y=132.838x-11.6703，本方法为外标法，故采用标准曲线拟合测量不确定度。

根据公式：

式中：Sy表示标准工作溶液测得峰面积残差的标准偏差；b表示标准工作曲线回归方程的斜率；p表示样品溶液测定次数；n表示标准工作溶液的测定次数。

因此，由标准曲线拟合过程引入的相对标准不确定度为：

2.6" "重复性测定引入的不确定度

样品重复性测定的不确定度主要来源于实验过程中方法、人员操作、试剂耗材等导致的峰面积的变动。由此可见，不确定度[uR]很难精确评估，因此以A类评估为主，B类评估为辅，根据实验方法测定6个平行样品，对6次平行实验结果进行统计（见表4），其标准偏差[sy]作为不确定度[Uy]，包含了以上变动性导致的不确定度。

重复性标准偏差：

则测量重复性的不确定度为：

2.7" "不确定度的合成、扩展和表示

液相色谱串联质谱法测定保健食品中西地那非不确定度分量及测量结果如表5所示。

合成不确定度：

取包含因子k=2，保健食品中西地那非含量为0.7878 μg/mL，则扩展不确定度为：

3" " "结论

本研究针对最新的保健食品中西地那非的检测方法——超高效液相色谱-串联质谱法，首次对该方法的不确定度进行评估。结果显示，标准溶液的配制和标准曲线拟合是检测结果的不确定度的主要来源，样品的量取、定容、稀释和重复性测定对不确定度的影响相对较小。在标准溶液配制过程中由微量移液器引入的不确定度较高，因此可选择体积较大的计量器具来配制标准溶液，进而降低由微量移液器引入的不确定度。标准曲线拟合引入的不确定度可以通过使用更多浓度水平的标准溶液来构建标准曲线，并且避免在高浓度或者低浓度出现非线性响应，进而增加拟合精度。通过对超高效液相色谱-串联质谱法测定保健食品中西地那非的不确定度进行评定，找出影响结果不确定度的主要因素，对影响检测结果的环节进行改进，进而保证精准检测。

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责任编辑" "孙" "涧

［收稿日期］" "2024-02-26

［基金项目］" "国家自然科学基金（81402889）

［作者简介］" "郭巧云（1986- ），女，博士，天津医学高等专科学校质谱应用技术实验室副教授，研究方向：临床质谱技术及应用。

龚子珊（1986- ），女，博士，天津医学高等专科学校质谱应用技术实验室讲师，#并列第一作者，研究方向：临床" " " 质谱技术及应用。

［通信作者］" "徐亮（1982- ），男，博士，天津医学高等专科学校质谱应用技术实验室、天津医科大学药学院教授，研究方向：分析化学。