不同氮水平下外源褪黑素对镉胁迫烟草幼苗生长及镉积累的影响

关键词：烟草幼苗；褪黑素；镉积累；硝态氮；非生物胁迫

中图分类号：S572.01 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2024）11-0106-08

镉（Cd）是一种用途广泛的金属，也是对生物体构成有害影响的元素之一。过量的Cd²⁺可能引发植物一系列严重的形态、生理和代谢紊乱，例如光合作用和蒸腾作用受到抑制、碳水化合物代谢紊乱、蛋白质降解和脂质过氧化。研究表明，低浓度的Cd对植物生长有一定的刺激作用。然而，过量的Cd会干扰植物细胞的新陈代谢和离子平衡，导致植株生长减慢、叶片变黄，作物生物量、品质和产量下降，甚至死亡。

褪黑素（melatonin，MT）是一种普遍存在于生物有机体的具有两亲性的吲哚杂环类化合物。褪黑素作为一种抗氧化剂参与植物胁迫的应激反应，清除植物体内过量的活性氧（ROS）和活性氮，减少细胞的活性氧损伤。MT还充当植物生理调节剂，其在植物中的生理功能主要表现在：调节植物生长、调节昼夜节律和光周期反应，提高植物抗逆性和抗氧化作用。刘自力等研究发现，与对照相比，100μmol/L MT处理显著提高小白菜幼苗的生物量和光合参数，并显著降低镉含量，减弱镉生长抑制和光抑制，从而提高烟草对镉的耐受性。Wang等研究发现，褪黑素可降低烟苗中HMA2和HMA4的转录水平，从而降低Cd从根部到木质部的易位效率，并且抑制Cd诱导的IRT1和Nramp1转录水平的上调，从而减少叶片中Cd的积累。另一项研究表明，100μmol/LMT和地衣芽孢杆菌处理可以增强菠菜的SOD、POD、CAT活性，从而促进对Cd的应激防御。Zhao等发现，寒冷胁迫下用200μmol/L MT处理可增强黄瓜幼苗的AsA-GSH循环酶活性，上调AsA-GSH循环酶生物合成相关基因的表达，激活AsA-GSH循环，维持氧化还原平衡，提高黄瓜幼苗的抗寒性。烟草属于富集和转运镉能力较强的经济作物，MT提高镉的耐受性在烟草上也得到证实：与对照相比，叶面喷施褪黑激素（特别是100μmol/L处理）减少烟草中的镉积累，减弱镉生长抑制和光抑制，从而提高烟草对镉的耐受性。

氮素在提高植物镉耐受性方面发挥着关键作用，高硝态氮可以提高植物的镉耐受性。最新的研究发现，褪黑素可以提高植物氮代谢及其基因的表达、提高酶活性、增强氮素的吸收与利用，从而提高植物对各种逆境胁迫的耐受性（冷害、干旱等）。重金属镉胁迫是一种重要的逆境胁迫，推测褪黑素可能与不同用量氮素互作而影响植物的镉耐受性，但到目前为止，其影响机制仍不清楚。因此，本试验采用水培方法，研究不同硝态氮水平与镉胁迫处理下，喷施外源褪黑素对烟草幼苗抗性生理特征及镉积累的影响，旨在探明其在缓解Cd胁迫过程中的作用，为摸清外源褪黑素调控烟草对Cd的耐受生理机制和进一步揭示烟草耐Cd机理提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料与烟苗培育

试验于2022年在河南农业大学烟草学院品质生态实验室的人工气候室内进行。供试烟草品种为K326，由河南农业大学烟草学院育种实验室提供。褪黑素试剂购于北京索莱宝科技有限公司。

试验采用无土栽培育苗。将烟草种子消毒后用无菌水清洗3次，点至育苗盘，并放置在人工智能培养箱中（昼／夜温度：28℃/25℃：昼／夜时长：14 h/10 h；湿度70%±5%）培养30d后移栽到盛有l/2Hoagland营养液的蛭石盆（规格：上、下口径分别为11、10cm，高8cm）中，每盆5株。待烟苗长至四叶一心时，挑选生长状况一致且健壮的烟苗移栽至5L水培盒中开展后续试验。

1.2试验设计与处理方法

本试验以NaNO₃作为氮源，将烟苗移栽至盛有不同浓度硝态氮的Hoagland营养液中进行3d驯化，而后同时进行Cd处理和MT喷施处理。本试验以CdCl₂·2.5H₂O作为镉源，加入去离子水溶解并配制成1mmol/L母液，之后试验过程中加入Hoagland营养液稀释至目标浓度（20μmol/L），营养液的更换频率为3d更换一次：同时连续喷施100μmol/L MT溶液7d，每株喷10 mL。MT喷施在上午进行，喷至叶片正反两面均匀布满水珠为宜，喷施后进行黑暗处理th，喷施间隔为24 h。

试验设置3个氮素营养条件，分别为高氮（Nl0：10 mmol/L）、正常供氮（N5：5 mmol/L）、低氮（NO.1：0.1mmol/L）。试验共设9个处理，分别为高氮营养条件下的NlO-Control、NlO-Cd、Nl0-Cd-MT;常氮营养条件下的N5-Control、N5-Cd、N5-Cd-MT;低氮营养条件下的NO.1 -Control、NO.l-Cd、NO.1-Cd-MT，每处理重复3次。处理后14 d记录烟苗表型并取样进行指标测定。

1.3测定指标及方法

1.3.1烟苗表型及生物量测定 烟样生物量（干重）用电子天平（型号：FB224）称量。

1.3.2叶片抗氧化酶活性及MDA含量测定 SOD（超氧化物歧化酶）、POD（过氧化物酶）、CAT（过氧化氢酶）、APX（抗坏血酸过氧化物酶）活性均采用试剂盒（北京索莱宝科技有限公司产品）说明书中的微量法测定；MDA（丙二醛）含量采用试剂盒说明书（苏州科铭生物技术有限公司产品）中的可见分光光度法测定。

1.3.3叶片AsA-GSH循环系统测定 AsA（抗坏血酸）、DHA（氧化型抗坏血酸）、GSH（还原型谷胱甘肽）、GSSG（氧化型谷胱甘肽）含量均采用试剂盒（北京索莱宝科技有限公司产品）说明书中的微量法测定。

1.3.4烟苗镉浓度测定 镉浓度采用湿式消解法[15]进行前处理，采用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS 7500A，美国Agilent产品）测定。转运系数=地上部Cd含量／根部Cd含量：转移系数=地上部Cd积累量／根部Cd积累量：滞留系数=根部Cd积累量／单株Cd积累量。

1.3.5基因表达分析 对各处理烟苗进行根部取样，并根据GenBank发布的烟草Cd转运相关基因序列设计扩增引物，以烟草核糖体蛋白编码基因Nt L25为内参基因，具体引物信息见表1。采用Trizol法提取烟苗根部总RNA，反转录合成cDNA。按照Vazyme公司的qPCR Master Mix（Taq Pro Universal SYBR）试剂盒说明书进行实时定量RT-PCR，每个样品重复3次。实时定量的结果采用2^-ΔΔCt方法进行分析。

1.4数据处理与分析

采用Micorosoft Excel 2021和SPSS 2018软件进行数据整理与分析，采用Origin 2021作图。

2结果与分析

2.1不同硝态氮水平下外源MT对镉胁迫烟草幼苗表型及生物量的影响

由图1可知，不同硝态氮水平下喷施MT能够缓解Cd毒害，且处理间存在显著差异。Cd胁迫下烟草幼苗地上部生物量显著降低，根系发育受到显著抑制：喷施MT后地上部生物量和根系表型显著缓解，地上部生物量不同硝态氮水平间差异显著，单株生物量与Cd胁迫处理相比分别提高87.50%、75.61%和89.29%。表明，镉胁迫下外源MT可有效提高幼苗生物量，N10和NO.1水平提升效果更好。

2.2不同硝态氨水平下外源MT对镉胁迫烟草幼苗抗氧化系统的影响

由图2可知，N10水平下Cd胁迫均提高烟叶SOD、POD、CAT、APX活性且除SOD外均达到显著水平，而NO.1水平下Cd胁迫却显著抑制烟叶SOD、POD、APX活性，表明硝态氮可促进烟草幼苗抗氧化系统的修复，维持氧化还原平衡。Cd胁迫下喷施MT处理中烟苗SOD、POD、CAT、APX活性大多显著高于单一Cd处理，其中SOD、POD、APX活性随硝态氮浓度增加而增加。与单一Cd处理相比，N5、NO.1水平下Cd胁迫喷施MT处理中烟苗MDA含量显著降低，且MDA含量随硝态氮浓度增加而降低。说明硝态氮可促进外源MT提高幼苗的抗氧化酶活性，缓解Cd毒害引起的膜脂过氧化反应，促进烟苗生长。

2.3不同硝态氨水平下外源MT对镉胁迫烟草幼苗AsA-GSH循环系统的影响

AsA、DHA、GSH、GSSG是参与AsA-GSH循环的关键非酶化合物。图3显示，Cd胁迫下，烟草幼苗AsA、GSH含量显著降低且随硝态氮浓度增加而增加，DHA、GSSG含量显著增加且随硝态氮浓度增加而降低。与单一Cd处理相比，Cd胁迫下喷施MT处理烟草幼苗中除NO.1水平下AsA增加不显著外，其他氮水平下AsA和GSH含量均显著增加，且随硝态氮浓度增加而增加；Cd胁迫下喷施MT可显著降低DHA、GSSG含量，且DHA、GSSG含量随硝态氮浓度降低呈上升趋势。表明，镉胁迫下，硝态氮可促进外源MT加快AsA-GSH循环的进行，以此来减少ROS积累。

2.4不同硝态氨水平下外源MT对镉胁迫烟草幼苗镉浓度及其积累量的影响

由图4可知，未添加Cd时，不同硝态氮水平下烟草幼苗地上部和地下部均未检出Cd。Cd处理后14d，不同硝态氮水平下地上部Cd浓度表现为N10gt;N5gt; NO.1，地下部Cd浓度也表现为N10gt;N5gt;NO.1，且不同处理间差异达到显著水平。喷施MT处理后，幼苗地上部和地下部Cd浓度均显著下降，并随硝态氮浓度降低而降低，与Cd处理相比，N10、N5、NO.1处理地上部Cd浓度降幅分别为18.62%、16.10%、20.77%，地下部Cd浓度降幅分别为12.75%、13.23%、11.91%，其中地上部Cd浓度中Nl0、NO.1水平下降幅较大，地下部Cd浓度降幅呈相反趋势。

由表2可以看出，Cd胁迫下Nl0处理（N10-Cd）烟草幼苗地上部Cd累积量最大，喷施MT后N10处理（N10-Cd-MT）地上部和根系Cd积累量分别减少3.33%、-18.10%，N5-Cd-MT处理分别减少6.68%、-29.41%，NO.1-Cd-MT处理分别减少12.29%、8.33%；3个氮水平下各处理单株Cd积累量均降低且N5、NO.1水平下达到显著水平。表明外源MT可抑制烟苗Cd的积累。

此外，随着硝态氮浓度的降低，Cd转移系数和转运系数呈现出先增加再降低的趋势，其中Nl0条件下各处理Cd转移系数高于NO.1，NO.1条件下各处理Cd转运系数高于N10;滞留系数变化趋势与两者相反，喷施MT后，Cd滞留系数增加。说明硝态氮可促进烟草幼苗生长，提高Cd的吸收与转运：硝态氮可促进外源MT提高根对Cd的滞留能力，降低Cd从根系向地上部的转运。

2.5不同硝态氧水平下外源MT对镉胁迫烟草幼苗根部镉吸收转运相关基因表达的影响

烟苗根部Cd吸收转运相关基因表达结果（图5）显示，Cd胁迫后，N10水平下NtIRT1、Nt-NRAMP3、Nt HMA2的相对表达量显著降低，N5水平下Nt IRT1、NtNRAMP3的相对表达量显著降低，NO.1水平下NtNRAMP1的相对表达量显著降低。与单一Cd胁迫相比，Cd胁迫下外施MT后N10水平中NtIRT1、NtNRAMP1、NtHMA2、NtHMA3的相对表达量不同程度地降低，而NO.1水平中Nt-IRT1、NtNRAMP1、Nt HMA3的相对表达量大多显著增加，且NtIRT1、NtNRAMP3、NtHMA2的相对表达量随硝态氮浓度的降低而降低。说明外源MT可通过下调Cd吸收及转运相关基因的表达来抑制烟苗对Cd的吸收，硝态氮的增施可促进MT对Cd吸收的抑制。

3讨论

植物农艺性状作为评价植株生长状况的指标之一，可以直观地展现出植株的表观特征。本研究结果显示.Cd胁迫下烟草幼苗生物量显著降低，植株生长受到抑制，而喷施MT后烟苗生物量得到有效恢复，其中生物量随硝态氮浓度的增加而增加。表明，增施硝态氮和外源MT对提升幼苗生物量具有积极作用，促进幼苗生长，缓解镉对烟草幼苗的毒害作用。

在非生物胁迫中，植物通过调节各种相关酶活性及物质含量来增强抗氧化防御体系，防止ROS的过度积累，保护细胞膜的通透性和完整性。外源MT会影响植物中的抗氧化酶活性。外施MT可增加干旱胁迫下苹果叶片的CAT和POD活性。本研究中，Cd胁迫对烟草幼苗SOD、POD、CAT、APX活性均有显著影响；Cd胁迫下喷施MT可进一步提高其活性，且随着硝态氮浓度的增加呈上升趋势。表明高硝态氮（N10）可促进外源MT提高烟苗抗逆性。除此之外，AsA和GSH是主要的非酶抗氧化剂，在细胞中起到氧化还原缓冲作用，维持ROS稳态，所以AsA与GSH在氧化应激中至关重要。本试验中，Cd胁迫下外施MT可显著增加AsA、GSH含量，降低DHA、GSSG含量，且随着硝态氮浓度的增加其促进作用增强。这表明，高硝态氮（N10）可促进外源MT通过触发烟苗非酶和酶抗氧化系统来维持氧化还原稳态，以防止Cd诱导氧化应激反应的发生。MDA是膜脂过氧化的产物，是植物叶片衰老的标志，对Cd毒害诱导的氧化损伤极为敏感。本试验中，Cd胁迫下外施MT各处理间MDA含量显著下降，MDA含量随硝态氮浓度增加而减少。说明硝态氮与外源MT互作对缓解烟草幼苗膜脂过氧化反应有积极作用，硝态氮能够促进烟苗生物量积累和代谢物质的合成，从而提高烟苗自身的防御机制。

本研究结果显示，喷施MT可显著降低烟苗Cd浓度，这与刘仕翔等的研究结果一致。就不同硝态氮水平而言，Cd胁迫下，烟草幼苗Cd吸收及累积量随硝态氮浓度增加而增加：N10处理Cd转移系数大于NO.1处理，外施MT后N10处理Cd滞留能力和转运能力小于NO.1，说明硝态氮可促进烟苗对Cd的吸收与积累，促进MT对Cd吸收的抑制作用。值得注意的是，无论是单一Cd处理还是Cd胁迫下外施MT处理，Nl0水平下幼苗地上部和根系的Cd浓度及累积量最高，根系对Cd的吸收和滞留能力高于其他处理。这表明硝态氮可增强根部对Cd的耐受性，其原因可能是烟草中的Cd发生化学螯合作用生成不易被植物利用的螯合物，减少Cd向地上部的迁移，增加了根对Cd的滞留能力。

对Cd胁迫下N10处理的Cd吸收转运关键基因的表达分析发现，NtIRT1、NtNRAMP1、Nt皿MA2、Nt HMA3在外施MT条件下低表达是导致烟苗Cd含量显著降低的主要原因，对Cd胁迫下NO.1处理的Cd转运关键基因的表达分析发现NtNRAMP3和Nt HMA2在Cd胁迫下低表达是导致烟苗Cd积累较低的主要原因，而NO.1水平中Nt IRT1、NtVtNRAMP1、NtHMA3的相对表达量上调是烟苗根系Cd积累量增加的原因，说明Nl0水平下外源MT可通过降低NtIRT1、NtNRAMP1、Nt-HMA2、Nt HMA3的表达来抑制烟苗对Cd的吸收，N0.1水平下外源MT可通过上调NtIRT1、Nt-NRAMP1、Nt HMA3的表达来促进烟苗Cd的转运。

4结论

不同硝态氮水平下外源MT对Cd胁迫的缓解能力存在差异。（1）高硝态氮（N10）下外施MT可显著提高烟草生物量和抗氧化酶活性，降低MDA含量，提高烟草Cd的耐受性。这可能是由于硝态氮增强了烟草幼苗自身的免疫能力，并促进Cd²⁺的螯合沉淀，降低活性Cd对烟草幼苗的毒害，提高了自身对Cd的耐受性。（2）低硝态氮（NO.1）下外施MT对提高烟草Cd耐受性的效果并不明显，但可有效降低烟草的Cd吸收能力，从源头上缓解Cd对烟草生长的毒害作用。其原因可能是，低氮下烟草幼苗生物量下降、生长活性降低，从而导致根系吸收能力下降。总的来说，高硝态氮有助于MT缓解镉胁迫，效果最好。