奶山羊睾丸支持细胞分离培养与鉴定

关键词：奶山羊；睾丸支持细胞；分离培养方法；鉴定；超微结构

中图分类号：S827 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2024）11-0141-07

奶山羊为重要的奶畜之一，近年来随着人们对奶类食品需求的增加，奶山羊养殖业得到快速发展。据联合国粮农组织（FAO）数据显示，2020年全球奶山羊存栏量为220 92.14万只，产奶量达206 2.96万吨，而且增产增量趋势明显。改善雄性奶山羊繁殖性能对于加快遗传改良、优化繁殖管理、提高产业经济效益具有重要意义。

睾丸是哺乳动物雄性生殖系统的重要组成部分，睾丸曲细精管复层上皮是产生精子的部位，由生精细胞和支持细胞（Sertoli cells，SCs）构成，其中SCs可为生精细胞提供营养、支持和保护，对维持精子正常发生具有重要意义。体外分离培养SCs可以模仿睾丸内部生理条件，同时可避免与周围细胞间相互作用，有助于更好地探究雄性生殖系统的生理过程及调控机制，目前已广泛应用于生殖毒理学、生殖内分泌学、发育生物学等方面的研究。

目前关于SCs分离培养方法的报道主要集中在人、小鼠、猪以及牛中，关于奶山羊的报道较少，且已报道的奶山羊SCs分离培养方法存在分离步骤繁琐、细胞纯度较低以及培养状态不稳定等问题，在一定程度上制约了对奶山羊雄性生殖系统的深入研究。因此，本研究以莎能奶山羊为实验动物对其SCs进行分离培养，比较了三种常用酶消化法的分离效率，并采用形态学及分子生物学技术对培养效果进行评估，旨在寻求经济、高效、可持续培养的奶山羊SCs分离培养方法，为深入开展奶山羊雄性生殖机能研究提供材料支撑。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物 2023年3月在陕西省千阳县种羊场选出6只2月龄、体重（10.33+1.00） kg、健康的雄性莎能奶山羊，用于睾丸采集。本研究经西北农林科技大学实验动物伦理委员会审查批准（批准编号：DY2023033）。

1.1.2主要试剂 胶原酶Ⅳ、胰蛋白酶、透明质酸酶Ⅱ和DNase Ⅰ购自美国Hyclone公司；细胞专用培养基（DMEM-F12）购自美国Sigma公司；胎牛血清（FBS）购自美国Zeta Life公司；兔抗WT1、鼠抗Vimentin、DAPI购自美国Abcam公司；荧光标记二抗购自武汉三鹰生物技术有限公司：台盼蓝染色液、三抗（青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液）、细胞增殖毒性检测试剂盒（cell counting

kit-8，CCK-8）、苏木素-伊红染色试剂盒、油红0染色试剂盒、中性树胶、抗荧光猝灭封片剂购自北京索莱宝生物科技有限公司。

1.1.3主要仪器 倒置荧光显微镜为德国Zeiss公司产品：研究级正置显微镜为日本Nikon公司产品：透射电子显微镜为美国FEI公司产品：自动荧光显微镜、超薄切片机为德国Leica公司产品；生物安全柜、细胞培养箱和CountessⅡ自动细胞计数仪均为美国Thermo Scientific公司产品。

1.2试验方法

1.2.1奶山羊睾丸支持细胞的分离 取莎能奶山羊睾丸组织，立即放人含2%三抗的PBS中清洗2min，之后转到生物安全柜中操作。剥离睾丸被膜后将其均等分成三份放人50mL离心管中，分别标为A、B、C三组，将每组的睾丸组织剪成约1mm3组织块，放入含2%三抗的PBS中清洗2次，各组加入不同的酶进行消化。所有试剂均37℃预热后使用。

A组（胰酶消化法）：将DMEM-F12培养基与0.25%胰酶等体积混合，配制0.125%胰酶消化液。睾丸组织加入0.125%胰酶消化液5mL，置于37℃振荡水浴锅中消化30 min。

B组（两步酶消化法）：使用DMEM-F12培养基配制1mg/mL的胶原酶Ⅳ消化液。睾丸组织加入1mg/mL胶原酶Ⅳ消化液5 mL，置于37℃振荡水浴锅中消化40 min;随后加入完全培养基（DMEM-F12培养基+10%胎牛血清+1%三抗，下同）清洗3遍，1000r/min离心5 min后加入0.25%胰酶，于37℃振荡水浴锅中消化15min。

C组（两步混合酶消化法）：使用DMEM-F12培养基配制两种酶混合液，酶混合液Ⅰ为1mg/mL胶原酶Ⅳ+1mg/mL透明质酸酶Ⅱ等体积混合，酶混合液Ⅱ为0.25%胰蛋白酶+5μg/mLDNase Ⅰ等体积混合。睾丸组织加入5 mL酶混合液Ⅰ，置于37℃振荡水浴锅中消化30 min;完全培养基清洗，1000r/min离心5 min后加入5mL酶混合液Ⅱ，于37℃振荡水浴锅中消化15min。

各组消化完成后，分别加入完全培养基终止消化，使用200目细胞过滤器过滤，1000r/min离心5 min，弃上清；用完全培养基重悬细胞，接种到培养皿中，置于细胞培养箱中培养（35℃，5%CO₂。下同）。

1.2.2细胞计数 取2.5mL刚分离的细胞悬液与2.5 mL 0.4%台盼蓝染色液混合均匀，倒置显微镜观察并进行细胞计数。

1.2.3 CCK-8检测细胞活率 将细胞悬液浓度调整为2xl05个/mL，接种于96孔板中，每孔100μL，每组设置5个重复，每间隔24 h进行一次CCK-8检测。具体操作为：每孔加入CCK-8试剂10μL，置于细胞培养箱中孵育2h，用多功能酶标仪测定波长450 nm下的吸光度值。

1.2.4细胞纯化 选择B组分离的细胞进行培养，4h后弃掉培养液，加入新鲜的完全培养基，以去除精原细胞、间质细胞等杂细胞。于第一次传代前加入20 mmol/L Tris-HCl低渗处理3 min，去除多余生殖细胞。

1.2.5细胞传代培养 细胞铺至70%～80%时，弃去培养液，PBS清洗2遍，加入0.25%胰酶，于显微镜下观察，当大量支持细胞缩成圆形时加入完全培养基终止消化。收集细胞悬液，离心去除胰酶，加入完全培养基重悬细胞，调整细胞浓度至1x10⁶个/mL并接种至培养皿中，置于细胞专用培养箱中培养。

1.2.6细胞形态观察 通过倒置荧光显微镜观察培养0、3、5、7d以及传代至第2、3、6代的细胞形态特征。

1.2.7 HE染色观察 取分离培养并传代至第3代的SCs接种到铺有细胞爬片的12孔板中，待细胞铺至70%～80%时，弃去培养基，PBS清洗3遍后用4%多聚甲醛固定液于室温下固定15 min，PBS清洗3遍。HE染色，脱水，封片，显微镜观察并拍照。

1.2.8油红O染色 用1.2.7中的方法制作细胞爬片，用60%油红O染色液进行染色，苏木素复染，自来水反蓝，甘油封片，显微镜观察并拍照。

1.2.9免疫荧光染色 用1.2.7中的方法制作细胞爬片，0.1% Triton X-100室温孵育30 min，PBS洗3遍；5% BSA室温封闭30 min后，分别加入一抗Vimentin（1：500）和WT1（1：300），4℃过夜孵育；PBST清洗3遍，加入对应种属的荧光二抗，室温避光孵育2h;PBST清洗3遍，加入DAPI避光孵育5 min;抗荧光猝灭剂封片，荧光显微镜观察并拍照。

1.2.10透射电子显微镜 取传代培养至第3代的SCs，1000r/min离心5 min清洗，2.5%戊二醛固定12h;PBS漂洗3遍，锇酸固定4 h；梯度浓度乙醇脱水，梯度浓度LR White渗透并包埋：超薄切片机切取80 nm切片，并附于铜网上；铀铅染色，室温干燥，透射电子显微镜观察并拍照。

1.3数据统计分析

试验数据以“平均值±标准误”表示，使用SPSS 20.0软件进行分析，独立样本t检验进行差异性比较，以Plt;0.05为差异显著性判断标准。

2结果与分析

2.1不同酶消化法分离的奶山羊睾丸支持细胞活性

分别采用胰酶消化法（A组）、两步酶消化法（B组）和两步混合酶消化法（C组）分离莎能奶山羊SCs，并利用台盼蓝染色法检测三种分离方法获得的细胞密度和活率。结果显示：胰酶消化法获得的细胞密度为（81.2+1.61） ×10⁵个/mL，显著低于两步酶消化法的（91.63+1.94）×10⁵个/mL和两步混合酶消化法的（92.74+2.26）×10⁵个/mL（Plt;0.05）（图1A）；两步酶消化法和两步混合酶消化法所获细胞活率分别为（97.84+0.65）%和（97.38±0.88）%，均显著高于胰酶消化法的（89.85±1.45）%（Plt;0.05）（图1B）。进一步通过CCK-8法检测三种分离方法所获细胞的增殖能力，结果（图1C）显示，随着培养时间延长，三种分离方法得到的SCs增殖曲线呈典型“S”形，符合正常细胞增殖规律：三种消化法分离获得的细胞均于3d时进入对数生长期，6～7 d增殖速度减慢，进入生长平台期，但相较于两步酶消化法和两步混合酶消化法，胰酶消化法获得的细胞增殖活力较低。综合来看，两步酶消化法得到的细胞活力较好且步骤较为简便，因此选择两步酶消化法进行后续SCs培养效果的评估。

2.2不同培养阶段奶山羊睾丸支持细胞形态特征

利用差速贴壁法对两步酶消化法获得的SCs进行纯化，并连续传代培养，在第一次传代前使用Tris-HCl缓冲液低渗处理进一步去除生殖细胞。倒置显微镜观察不同时期细胞形态，结果显示：刚分离的细胞呈圆形，体积较小，折光性强（图2A）；第3天时，大部分细胞已贴壁，细胞呈梭形，体积增大，并有多边形或星状突起（图2B）；第5天时，细胞已铺满培养皿底的95%，细胞形态为扁平状，细胞质增多，体积增大，折光性减弱（图2C）；第7天时，细胞已经完全铺满培养皿底，细胞形态与第5天时相似（图2D）。传代至第2代，细胞贴壁稳定，分布均匀，排列紧密，相互连接呈片状（图2E）；传代至第3代，细胞贴壁速度变快，细胞形状更为扁平（图2F）；传代至第6代，细胞贴壁速度变慢，细胞体积减小，细胞突起萎缩，部分细胞可见细胞质空泡化、细胞核固缩（图2G）。

2.3奶山羊睾丸支持细胞HE、油红O染色及免疫荧光染色

取传代培养至第3代的SCs进行染色鉴定。HE染色结果（图3A、B）显示：细胞形状不规则，具有一个或多个较粗的突起，且突起相互连接；细胞质丰富，细胞核呈圆形或椭圆形，位于细胞质中央，细胞核中可观察到双极小体。油红O染色结果（图3C、D）显示：细胞质中分布大小不一的脂滴，多位于细胞核周围或胞质两极。免疫荧光染色结果（图4）显示：WT1蛋白特异性表达于SCs的细胞核中：Vimentin蛋白覆盖细胞质，并环绕着细胞核，构成细胞骨架。细胞计数WT1和Vimen-tin抗体阳性率为（96.8±0.2）%。上述结果表明两步酶消化法所获细胞为SCs且纯度高。

2.4奶山羊睾丸支持细胞超微结构

透射电镜观察第3代SCs，结果（图5）显示：细胞结构完整，呈不规则圆柱形。细胞质内细胞器丰富，线粒体呈管状，嵴结构清晰，形态结构完整；内质网数量较多且结构完整，滑面型内质网和粗面型内质网相延续；溶酶体多有髓鞘样结构；高尔基体发达，可见分泌囊泡。细胞核大且明显，形状不规则，染色质密度低，染色较浅，核仁明显，具有睾丸SCs特有的结构——双极小体。上述结果符合SCs超微结构特征。

3讨论与结论

体外培养SCs是研究雄性生殖机理的基础技术，为深入探究和阐明雄性生殖系统相关问题提供重要科研材料。本研究以2月龄雄性莎能奶山羊为试验动物，比较不同酶消化法分离SCs的效率，并评估SCs培养效果，旨在选出一种经济、高效的奶山羊SCs分离培养方法。

已有的SCs分离方法包括机械分离法和酶消化法两种。机械分离法会对细胞膜造成严重损伤，且分离效率较低，因此很少使用。而酶消化法能够利用酶特异性消化的特点温和分离细胞，具有保持细胞较高活力和维持细胞膜完整性等优点，被广泛使用。杨璐等采用胰酶消化法分离新生黑山羊SCs;Zhang等利用两步酶消化法（胶原酶Ⅳ+胰酶）分离得到纯度较高的山羊SCs;Su等通过更为复杂的两步混合酶消化法（胶原酶Ⅳ与透明质酸酶混合液+胰酶与DNase Ⅰ混合液）成功分离了绒山羊的SCs.并用于长期培养与研究。本研究比较了上述三种酶消化法分离莎能奶山羊SCs的效果，结果表明，两步酶消化法与两步混合酶消化法所获细胞数量、细胞活率和细胞增殖力均显著高于胰酶消化法。而胰酶容易过度消化，破坏细胞膜表面的膜蛋白，对细胞造成较大损伤，这可能是单独使用胰酶消化分离奶山羊SCs效果较差的原因。两步酶消化法与两步混合酶消化法分离奶山羊SCs的效果相似，但两步混合酶消化法需要酶种类较多，成本较高，相比之下两步酶消化法的可操作性与经济性较好，为三种方法中的最佳方法。

刚分离的原代SCs常会有生殖细胞污染，需对其进行纯化处理。常用的SCs纯化方法有差速贴壁法和Tris-HCl低渗法两种。差速贴壁法利用SCs贴壁能力较强的特性去除杂细胞，Tris-HCl低渗法则是利用其低渗耐受性去除生殖细胞。高艺等利用差速贴壁法获得了纯度较高的江香猪SCs，王亚营采用Tris-HCl低渗法去除了牦牛SCs中的生殖细胞：刘博通过差速贴壁法结合Tris-HCl低渗法获得了高纯度的小鼠SCs。本研究在原代SCs培养4h后使用差速贴壁法进行纯化，并在第一次传代前使用20 mmol/LTris-HCl（pH=7.4）处理，纯化后的细胞经鉴定纯度大于96%，表明该种方法可获得高纯度的奶山羊SCs。

形态学观察是衡量SCs生长特性的重要方法。本研究利用倒置显微镜对两步酶消化法分离的细胞进行观察，发现分离的细胞具有典型SCs形态，且在连续传代培养至第5代时仍保持正常SCs形态。鉴定SCs常用的方法有染色法和免疫学方法。HE染色后可明显观察到SCs形态和细胞核内深着色的双极小体，油红0染色能将富含脂滴的SCs与生殖细胞区分开，因此常采用HE和油红O染色鉴定SCs。免疫学方法则是通过免疫组化或免疫荧光等手段检测SCs的特异性标志蛋白，例如Wilms肿瘤蛋白1（WT1）和波形蛋白（Vimentin）等。本研究通过HE染色、油红0染色以及WT1和Vimentin免疫荧光染色对传代培养至第3代的SCs进行鉴定。HE染色和油红O染色观察到的细胞呈不规则形状，细胞核内有双极小体，细胞质中存在大小不一的脂滴等SCs典型特征。与王雪等的染色结果相似，WT1绿色荧光特异性表达于SCs细胞核，Vimen-tin绿色荧光特异性表达于细胞骨架。超微结构是判断SCs生物学特性的重要指标。本研究利用透射电子显微镜观察第三代SCs超微结构，结果显示SCs结构完整，内含丰富的细胞器，与Shi等观察到的黑山羊SCs超微结构一致。以上结果表明，两步酶法分离得到的细胞具有典型SCs的形态特征，可用于后续支持细胞体外培养研究。

综上，两步酶消化法（胶原酶Ⅳ+胰酶）可获得数量多、活力好、纯度高且形态特点典型的奶山羊SCs，为深入开展奶山羊雄性生殖机理研究提供良好的细胞学模型。