油茶籽功能性成分的提取、鉴定及其活性评价

摘要：油茶籽广泛种植于我国南方地区，是食用植物油的重要原料。为了探明其有效成分，文章首先通过气相色谱-质谱法对其挥发性成分进行分析。其中，顺-十八碳烯酸、n-十六酸、7-丁基苯并[a]蒽等成分的含量较高，并发现生育酚、角鲨烯等活性成分。随后采用超声强化溶剂提取法对油茶籽中的功能性因子进行提取，并探究了超声温度、pH、乙醇浓度、料液比对活性成分提取率的影响。4个因素对酚类物质提取率的影响次序为pH＞超声温度＞乙醇浓度＞料液比，且超声温度和乙醇浓度的交互作用最强。通过响应面优化后，得到总酚的最佳提取工艺条件为超声温度45 ℃、乙醇浓度40%、料液比1∶10、pH 4。抗氧化活性实验结果表明，其半抑制浓度IC50为39.72 mg/mL，其在抗炎、抗肿瘤领域的功效值得进一步研究。

关键词：油茶籽；索氏提取；超声强化；挥发性成分；气相色谱-质谱法（GC-MS）

中图分类号：TS222.1""""" 文献标志码：A"""" 文章编号：1000-9973（2024）11-0021-09

Extraction， Identification and Activity Evaluation of Functional Components

of Camellia oleifera Seeds

WEN Zhuo1， HUANG Yong-chun1，2，3*， TANG Xiang-yi1，2，4*

（1.College of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Science and Technology，

Liuzhou 545006， China; 2.Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources，

Liuzhou 545006， China; 3.Guangxi Liuzhou Luosifen Engineering Technology Research

Center， Liuzhou 545006， China; 4.School of Food Science and Engineering，

South China University of Technology， Guangzhou 510640， China）

Abstract： Camellia oleifera seeds are widely planted in southern China and they are important raw materials for edible vegetable oils. In order to find out the active components， the volatile components are analyzed by gas chromatography-mass spectrometry. Among them， the content of cis-vaccenic acid， n-hexadecanoic acid and 7-butylbenz[a]anthracene is higher， and active components such as tocopherol and squalene are found. The functional factors in Camellia oleifera seeds are extracted by ultrasonic enhanced solvent extraction method， and the effects of ultrasonic temperature， pH， ethanol concentration and solid-liquid ratio on the extraction rate of active components are investigated. The four factors affect the extraction rate of phenolic substances in the order of pHgt;ultrasonic temperaturegt;ethanol concentrationgt;solid-liquid ratio， and the interaction effect between ultrasonic temperature and ethanol concentration is the strongest. The optimal extraction conditions of total phenols are as follows： the ultrasonic temperature is 45 ℃， the ethanol concentration is 40%， the solid-liquid ratio is1∶10 and the pH is 4. The experimental results of antioxidant activity show that the semiinhibitory concentration IC50is 39.72 mg/mL， and their efficacy in antiinflammatory and antitumor fields is worthy of further study.

Key words：Camellia oleifera -seeds; Soxhlet extraction; ultrasonic enhancement; volatile components; gas chromatography-mass spectrometry （GCMS）

收稿日期：2024-04-24

基金项目：中国博士后科学基金项目（2023MD734187）；广西科技基地和人才专项科学基金项目（2021AC19460）

作者简介：文卓（1998—），男，硕士，研究方向：功能性油脂。

*通信作者：黄永春（1974—），男，教授，博士，研究方向：生物资源加工技术与过程强化；

唐湘毅（1990—），男，讲师，博士，研究方向：功能性碳水化合物。

油茶是山茶科山茶属，是一种高脂肪含量的植物，并且具有一定的经济价值。茶油由油茶籽去皮后榨取而得，油茶籽是我国特有的具有较长历史的木本油料植物[1]。中国是世界上最大的茶油生产地，其种植主要分布在华南、中南、西南等地区，是我国一种特有的植物油[2-3]。油茶品种繁多，如普通油茶、小果油茶、浙江红花油茶等[4]。

油茶籽制取出的茶油具有脂肪酸、黄酮类、维生素E、维生素D、亚油酸、茶多酚、角鲨烯等多种有益成分，能够帮助肠胃蠕动，促进消化，美肤养颜，减脂，抗衰老，增强人体免疫力，预防和减轻动脉粥样硬化、胆固醇、高血压、高血脂等心脑血管疾病[5-8]。茶油是一种能和橄榄油媲美的植物油，拥有“东方橄榄油”、“油中之王”的美誉[9]。山茶油作为中国南方部分省份常见的食用油，因富含多酚类、植物固醇类等不皂化物，被认为是高营养价值的珍贵产品[10]。茶油不仅能用于食品行业，而且能用于化妆品行业、药业、化学工业，有着良好的发展前景[11-13]。

为了探明油茶籽中的挥发性成分及其醇提物的生物活性，本文首先以油茶籽为研究对象，采用索氏提取技术，分别以无水乙醇和石油醚为溶剂，并利用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）对油茶籽中的挥发性成分进行提取、分离和鉴定，比较了不同溶剂对提取物成分的影响。随后采用超声波强化溶剂提取技术研究超声温度、pH、乙醇浓度、料液比对醇提物和酚类物质提取率的影响，通过响应面法对提取工艺进行优化，并采用DPPH自由基清除率实验对油茶籽的生物活性进行初步评价。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

无水乙醇（药用级，99.5%）：上海麦克林生化科技有限公司；石油醚（分析纯）：四川西陇科学有限公司；没食子酸（HPLC≥98%）：中原植提标准品经销中心；DPPH（≥97.0%）：福州飞净生物科技有限公司；福林酚试剂（分析纯）：合肥巴斯夫生物科技有限公司；正己烷（分析纯）：美国安捷伦科技公司。

1.2 仪器与设备

7890B-7000C气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦科技公司；RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；Alpha 1-2 LD-Plus冷冻干燥机 迪图（上海）生物科技有限公司；H1850高速台式离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司；UV-2006紫外可见分光光度计 岛津企业管理（中国）有限公司；101-3AB电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 油茶籽粉的制备

将500 g干油茶籽进行筛选，使用粉碎机对油茶籽进行间歇式粉碎（粉碎时间为10～15 s，间隔时间为3～5 s），粉碎后使用60目筛进行过筛并密封保存，备用。

1.3.2 油茶籽中挥发性成分的提取

称取15 g粉碎后的油茶籽粉，使用滤纸折叠成桶状包住并封口，使用脱脂棉绳进行捆绑，防止样品泄露。捆绑好后将其放入提取筒内，将其余索氏提取器装置连接，冷水从下端入口进入，从上端出口排出。分别以无水乙醇和石油醚为有机溶剂，倒至烧瓶的2/3体积，开启冷凝水，将索氏提取器的烧瓶放置并浸没在80 ℃的水浴锅中进行水浴加热，在冷凝管口塞入一小团棉花，索氏提取9 h[14]。提取完毕后，关掉冷凝水，从上至下拆卸索氏提取器，取出烧瓶，略微倾斜索氏提取器，将里面所有液体都倒入烧瓶中。通过旋转蒸发仪将其中的有机溶剂去除[15-16]，即得挥发油，放入冰箱中冷藏待用。

1.3.3 气相色谱-质谱联用仪测定不同提取方式茶油的成分

气相色谱-质谱条件：色谱柱：DB-5弹性石英毛细管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；升温程序：起始柱温为50 ℃，保持8 min；以8 ℃/min的升温速度升至150 ℃，保持2 min；再以4 ℃/min的升温速度升至170 ℃，保持2 min；然后以2 ℃/min的升温速度升至200 ℃，保持5 min；最后以5 ℃/min的升温速度升至280 ℃，保持5 min；进样口温度：280 ℃；载气：高纯氦气；流量：1 mL/min；进样量：1 μL（挥发油样品用正己烷稀释）；分流比：10∶1。质谱条件：接口温度：300 ℃；离子源温度：230 ℃；电子能量：70 eV；质量扫描范围（m/z）：33～400 amu；发射电流：34.6 VA；电子倍增器电压：1 392 V。

油茶籽挥发油中各化合物的相对保留时间可以通过正构烷烃的保留时间计算得到，综合以下两个方法鉴定茶油挥发性物质：与NIST和NBS标准谱库检索结果对比匹配相似度大于90%；将挥发性化合物的相对保留时间与文献报道的数据进行对比。茶油中各挥发性化合物的相对含量采用面积归一化法计算得到[17]。

1.3.4 超声空化提取酚类物质

选择4个单因素对油茶籽粉进行超声空化提取，分别是超声温度、乙醇浓度、料液比、pH，并研究其对酚类物质提取率的影响。

1.3.5 总酚的测定

没食子酸标准曲线的绘制参考张恬恬的方法[17]。粗提物中酚类物质的测定采用福林酚法，其计算公式如下：

总酚提取率（%）=C×n×V1M×100%。

式中：C为总酚的质量浓度（mg/mL）；n为稀释倍数；V1为提取液体积；M为油茶质量（mg）。

1.3.6 DPPH自由基清除剂评价活性物质

配制0.2 g/mL的DPPH溶液作为储备液，稀释5倍作为工作液。配制不同浓度的样品溶液。取DPPH工作液各2 mL与等体积样品混合均匀，于室温下避光反应30 min。随后在517 nm处测定吸光值，以未添加DPPH的试样为空白组，添加DPPH的试样为对照组。清除率（Q）计算公式如下[18]：

Q（%）=[1-（A1-A2）/A3]×100%。

式中：A1为样品组（加入样品和DPPH溶液）的吸光值；A2空白组（只加入样品溶液）的吸光值；A3为对照组（只加入DPPH溶液）的吸光值。

2 结果与分析

2.1 气相色谱-质谱联用鉴定精油成分

运用索氏提取技术通过不同的溶剂提取得到的茶油均呈黄色且伴有特殊香味，以乙醇为溶剂的提取率为6.72%，以石油醚为溶剂的提取率为11.46%，索氏石油醚提取法的提取率大于索氏乙醇提取法。

经过气质分析后得到典型总离子流图，见图1。

索氏乙醇提取法提取的挥发油成分及含量见表1。

由表1可知，通过索氏乙醇提取法提取的挥发油中共鉴定出33种挥发性成分，其中包括6种有机酸类（18.18%），6种酯类（18.18%），5种酰类（15.15%），3种酮类（9.09%），2种烯烃类（6.06%），1种醚类（3.03%），以及其他类（30.31%）。经比对鉴定，通过索氏乙醇提取法提取的茶油挥发油成分中顺-十八碳烯酸的含量最高，面积归一化百分比为56.26%，其次为7-丁基苯并[a]蒽，面积归一化百分比为9.69%，以及n-十六酸（7.47%）、γ-谷甾醇（3.89%）、油酰氯（3.25%）、4-菜籽甾烯-3-酮（2.92%）、顺-13-二十碳烯酸（2.12%）、菜油甾醇（1.37%）、豆甾-3，5-二烯（1.3%）等。

索氏石油醚提取法提取的挥发油成分及含量见表2。

由表2可知，通过索氏石油醚提取法提取的挥发油中共鉴定出39种挥发性成分，其中包括6种烯烃类（15.38%），6种酯类（15.38%），4种有机酸类（10.26%），2种酰类（5.13%），2种苯类（5.13%），2种烷烃类（5.13%），2种呋喃类（5.13%），1种醚类（2.56%），1种酮类（2.56%），以及其他类（12.82%）。经比对鉴定，通过索氏石油醚提取法提取到的茶油挥发油成分中顺-十八碳烯酸的含量最高，面积归一化百分比为66.72%，其次是n-十六酸，面积归一化百分比为9.66%，以及硬脂酸乙烯酯（3.05%）、花生酸（2.18%）、DL-α-生育酚（1.78%）、顺-11-二十碳烯酸（1.56%）、顺-11-二十碳烯酸（1.35%）、2-十六酮（1.16%）、γ-生育酚（1.01%）等[19]。

值得一提的是，两种溶剂提取得到的挥发油成分中角鲨烯（squalene）的面积归一化百分比分别为0.34%和0.14%，说明以乙醇为溶剂得到的挥发油中角鲨烯含量较高。而维生素E在两种提取方法得到的挥发油中的面积归一化百分比分别为1.94%和2.79%，说明以石油醚为溶剂能够提取并鉴别出更多的维生素E成分[20]。

2.2 超声空化提取工艺条件对醇溶性功能因子提取率的影响

古籍记载，茶油性偏凉，有凉血、止血之功效，研究表明，油茶籽中除了含有大量的不饱和脂肪酸外，还含有角鲨烯、维生素E、甾醇、酚类等小分子活性成分[21]。

2.2.1 温度对样品粗提物的影响

由图2可知，随着温度的升高，醇溶性功能因子的提取率呈先升高后降低的趋势，在温度为40 ℃时达到最大值，为11.46%。高温可促进分子的运动，提高细胞的通透性，有利于活性成分的溶出，然而过高的温度可能会造成这些物质的降解，进一步提高温度不利于醇溶性功能因子的提取。因此，油茶籽中醇溶性功能因子的最佳提取温度为40 ℃。

2.2.2 乙醇浓度对样品粗提物的影响

由图3可知，随着乙醇浓度逐渐升高，粗提物的提取率先缓慢升高后降低，并且在乙醇浓度为40%时最大，为8.93%，原因可能是随着乙醇浓度的增加，提取溶剂的极性逐渐降低，而油茶籽醇溶性功能因子大多为中等极性物质，根据相似相溶原理，油茶籽中醇溶性功能因子的提取率随着乙醇浓度的增大呈现先升高后降低的趋势。因此，最佳的乙醇浓度为40%。

2.2.3 料液比对样品粗提物的影响

由图4可知，随着料液比的增大，粗提物的提取率逐渐升高，当料液比为1∶12时提取率最大。料液比越小越有利于物质在溶剂中的扩散，所以提取率逐渐升高，但料液比过高不利于活性物质的回收，蒸发需要更多的能耗，提取速率下降。因此，最佳料液比为1∶12。

2.2.4 pH对样品粗提物的影响

由图5可知，随着pH升高，粗提物的提取率先升高后降低，且在pH为4时提取率最大，为11.73%，低pH可能使茶油的渗透性发生变化，不利于小分子物质的溶出。因此，最佳pH为4。

2.3 总酚

2.3.1 没食子酸标准曲线

从测量结果可以看出，在测量范围内，没食子酸浓度与吸光度呈线性关系，相关系数R2为0.998 6，回归方程为Y=0.005 7x+0.016 7，见图6。

2.3.2 超声温度对粗提物总酚提取率的影响

由图7可知，油茶籽的总酚提取率随着超声温度的升高呈升高趋势，在超声温度为60 ℃时达最大值，为11.84%。随着超声温度的升高，组织细胞的通透性更强，有利于有效成分的释放。因此，最佳超声温度为60 ℃。

2.3.3 乙醇浓度对粗提物总酚提取率的影响

由图8可知，油茶籽的总酚提取率随着乙醇浓度的升高呈先增大后减小的趋势，当乙醇浓度为40%时达到最大值，为10.42%，原因可能是油茶籽中醇溶性功能因子大多为中等极性物质，由于相似相溶原理，酚类物质易溶于乙醇，随着乙醇浓度的增加，酚类物质的提取达到饱和，同时其他物质如醇溶性杂质、色素等成分的溶出量增加，从而导致总酚提取率下降[22]。因此，最佳乙醇浓度为40%。

2.3.4 料液比对粗提物总酚提取率的影响

由图9可知，随着超声空化料液比的增大，总酚提取率随之增加，当料液比为1∶12时达最大值，为9.17%。溶剂增大时，浓度差变大，有利于酚类物质的扩散，溶液能够更好地传输物质。因此，最佳料液比为1∶12。

2.3.5 pH对粗提物总酚提取率的影响

由图10可知，随着pH的增加，总酚的提取率呈先增大后减小的趋势，在pH为4时最大，为10.91%。pH过高或过低均会抑制样品中酚类物质的提取。因此，最佳pH为4。

2.4 DPPH自由基清除率

由图11可知，随着粗提物浓度的增加，对DPPH自由基的清除率也随之增大，当粗提物浓度为25 mg/mL时，DPPH自由基清除率最高，为35.5%。

2.5 响应面分析

2.5.1 响应面实验模型设计结果与显著性分析

基于超声空化单因素实验，通过Design-Expert 8.0.6 Trial软件，设置自变量为超声温度（A）、乙醇浓度（B）、料液比（C）、pH（D），设置响应值为油茶籽总酚提取率（Y），使用响应面法对油茶籽总酚的提取工艺进行优化，进行四因素三水平响应面实验，见表3。

通过Design-Expert 8.0.6 Trial软件共设计4个因素29个处理组，其中包含5个零点实验和24个析因实验。每个实验重复处理3次，以所得油茶籽样品总酚提取率均值作为响应值（Y）。响应面试验模型设计及结果见表4。

通过Design-Expert 8.0.6 Trial软件对实验结果进行回归拟合分析，计算得Y与A、B、C、D之间的回归方程[23]：总酚提取率（Y）=13.10-0.35A-0.15B-0.072C-0.38D+0.41AB-0.010AC+0.087AD-0.33BC-0.18BD+0.31CD-0.79A2-0.88B2-0.64C2-1.19D2。

由表5可知，回归模型的P＜0.000 1，F值为22.64，回归模型的结果极显著，建立此模型具有统计学意义，且失拟项的P值为0.138 5，失拟项不显著，与实际情况有着较好的拟合度，能够有效反映各因素之间的相关性，可以用此回归方程方差和模型来分析油茶籽的总酚提取率[24]。

根据表5中F值和显著水平可以看出，因素A（超声温度）、B（乙醇浓度）、C（料液比）、D（pH）对总酚提取率的影响次序为D＞A＞B＞C。A2、B2、C2、D2的P值均＜0.000 1，因此超声温度、乙醇浓度、料液比、pH这4个因素都对油茶籽的总酚提取率有显著影响。由表5中交互项可知，P值ABlt;BClt;CDlt;BDlt;ADlt;AC，所以其影响大小为AB＞BC＞CD＞BD＞AD＞AC，因此各因素对油茶籽总酚提取率的影响都不是简单的线性关系[25]。根据F值可以得出，各因素两两之间的交互作用的P＞0.05，说明超声温度、乙醇浓度、料液比、pH这4个因素的交互作用对油茶籽总酚提取率的影响不显著[26]。

2.5.2" 响应面交互作用分析

各因素两两交互作用的响应曲面图见图12。

由图12可知，在交互项中，对油茶籽总酚提取率的影响次序为AB＞BC＞CD＞BD＞AD＞AC。超声温度和乙醇浓度的交互作用最显著，坡度最陡，等高线呈椭圆形，其他因素间的坡度相对平滑，交互作用相对较小。

2.5.3 优化条件的模型认证

利用Design-Expert 8.0.6 Trial软件得到最佳工艺参数，并得到油茶籽的总酚提取率为（12.67±0.843）%，与之前计算的预测值偏差为1.707%，达到回归模型预测提取率98.293%，说明该实验结果与模型预测值基本符合[27]。

3 结论

本实验以油茶籽为研究对象，探究了不同的溶剂对其成分的影响，研究了不同因素的超声空化处理对其醇溶性物质和总酚的影响[28]，对其提取工艺进行了优化，并采用DPPH自由基清除率实验对油茶籽醇提物的生物活性进行了评价。通过本实验可以得到以下结论：

探究了不同溶剂的索氏提取法对其挥发性成分的影响。通过索氏无水乙醇提取法和索氏石油醚提取法两种提取方式提取油茶籽挥发性成分，索氏无水乙醇提取法的提取率（6.72%）低于索氏石油醚提取法的提取率（11.46%）。两种提取方法分别得到33种和39种挥发性物质，两种提取方法中顺-十八碳烯酸的含量最高，此外，以乙醇为溶剂提取得到的挥发油成分中含量较多的为

7-丁基苯并[a]蒽、n-十六酸、γ-谷甾醇，而以石油醚为溶剂提取得到的挥发性成分中含量较多的为n-十六酸、硬脂酸乙烯酯、花生酸。并且以乙醇为溶剂得到的挥发油成分中角鲨烯的含量较以石油醚为溶剂提取的高，以石油醚为溶剂得到的挥发油成分中维生素E的含量较以乙醇为溶剂提取的高。

研究了不同因素的超声空化处理对其粗提物和总酚的影响，并对其提取工艺进行了优化。超声空化处理过程中，在测量范围内，当温度升高时，粗提物提取率也随之增大，在40 ℃时提取率最大，之后呈下降趋势。随着乙醇浓度逐渐增加，粗提物的提取率呈现先增大后减小的趋势，且在浓度为40%时达到最大。料液比与粗提物提取率呈正相关，当料液比为1∶12时提取率达到最大。随着pH的增大，粗提物提取率呈先升高后降低的趋势，在pH为4时提取率最大。超声空化提取酚类物质过程中[29]，随着温度的升高，总酚提取率也随之增大；随着乙醇浓度的增大，总酚提取率先升高后降低；随着料液比的增大，总酚提取率呈持续升高的趋势；随着pH的增大，总酚提取率先升高后降低。因此，超声空化提取酚类物质的最佳条件为超声温度60 ℃、乙醇浓度40%、料液比1∶12、pH 4，并且超声温度和乙醇浓度的交互作用最显著。通过响应面优化后得到的提取酚类物质的最佳工艺为超声温度45 ℃、乙醇浓度40%、料液比1∶10、pH 4。

对油茶籽醇溶性功能因子的生物活性进行了评价，随着茶油浓度的不断升高，DPPH自由基清除率也随之增大，浓度与DPPH自由基清除率呈正相关，油茶籽乙醇粗提物具有良好的DPPH自由基清除能力，其半抑制浓度IC50为39.72 mg/mL。浓度越高，DPPH自由基清除率越高，茶油的抗氧化能力越强。

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