超声辅助酶法制备小基围虾调味料的研究

摘要：小基围虾常被当成下脚料丢弃或用于饲养家禽，造成环境污染及其营养价值的流失，为解决这一问题，文章以小基围虾为实验原料，采用响应面法优化超声辅助碱性蛋白酶水解工艺，在此基础上研发虾调味料。结果表明，小基围虾是一种高蛋白低脂肪的海虾，具有较高的营养价值。超声辅助碱性蛋白酶对小基围虾酶解效果的影响为超声功率gt;超声时间gt;酶解时间，其最佳酶解条件为超声功率326 W、超声时间38 min、酶解时间4 h，在此条件下水解度可达（24.84±0.52）%，比未超声处理增加了9.48%。在此基础上所制得的调味料的干燥失重为（4.12±0.29） g/100 g，氯化物含量为（7.86±0.62） g/100 g，总氮含量为（3.50±0.37） g/100 g，符合相关调味料理化指标标准，可为小基围虾的深加工和综合利用提供理论参考，也可为调味料新产品的开发提供理论参考。

关键词：小基围虾；超声；酶；响应面；调味料

中图分类号：TS264.9""""" 文献标志码：A"""" 文章编号：1000-9973（2024）09-0144-07

Study on Preparation of Small Metapenaeus ensis Seasonings by

Ultrasonic-Assisted Enzymatic Method

LAN Wei-bing1，2， LUO Fang-zhen1， LIU Hua-feng1， YOU Gang1，2， CHEN Mei-hua1，2，

ZHANG Zi-ran1，2， JIANG Hong-ming1， LIU Yuan-sen1， HAN Xin3*

（1.College of Food Engineering， Beibu Gulf University， Qinzhou 535000， China; 2.Beibu Gulf Key

Laboratory of High-value Utilization of Seafood and Prepared Food in Colleges and Universities in

Guangxi Province， Qinzhou 535000， China; 3.College of Mechanical and Shipbuilding Marine

Engineering， Beibu Gulf University， Qinzhou 535000， China）

Abstract： Small Metapenaeus ensis is often discarded as waste or used to feed poultry， causing environmental pollution and loss of nutritional value. In order to solve this problem， with small Metapenaeus ensis as the experimental raw material， response surface method is used to optimize the ultrasonic-assisted alkaline protease hydrolysis process， and on this basis， Metapenaeus ensis seasonings are developed. The results show that small Metapenaeus ensis is a kind of high-protein and low-fat sea shrimp and" has high nutritional value. The order of the effects of ultrasound-assisted alkaline protease on the enzymatic hydrolysis effect of small Metapenaeus ensis is ultrasonic powergt;ultrasonic timegt;enzymatic hydrolysis time， and the optimal enzymatic hydrolysis conditions are ultrasonic power of 326 W， ultrasonic time of 38 min and enzymatic hydrolysis time of 4 h. Under such conditions， the degree of hydrolysis reaches （23.84±0.52）%，which is 9.48% higher than that without ultrasonic treatment. The drying weight loss， chloride content and total nitrogen content of the seasonings prepared on this basis are （4.12±0.29）， （7.86±0.62）， （3.50±0.37） g/100 g" respectively， which are in line with the relevant standards for physicochemical indexes of seasonings. This study can provide theoretical references for the deep processing and comprehensive

utilization of small Metapenaeus ensis and also provide theoretical references for the development of new seasoning products.

Key words： small Metapenaeus ensis; ultrasound; enzyme; response surface; seasoning

收稿日期：2024-03-20

基金项目：广西自然科学基金项目（2023GXNSFBA026244，2022GXNSFBA035555）；广西高校中青年教师科研基础能力提升项目（2023KY0447）；北部湾大学高层次人才科研启动经费项目（23KYQD14，2021KYQD09）；广西壮族自治区自治区级别大学生创新创业训练计划项目（S202311607200）；中青年项目（2020KY10030）

作者简介：蓝尉冰（1987—），女，讲师，博士，研究方向：水产品加工。

*通信作者：韩鑫（1986—），男，讲师，博士，研究方向：数学模型建立。

随着人们对食物品质的要求不断提高，食品调味料备受关注，同时，人们也越来越追求绿色、健康、天然及富含营养的食品调味料。目前市面上常见的调味料偏向于以植物为原材料，对于富含氨基酸、核苷酸、牛磺酸等具有调味和保健功能的水产型调味料较少，且品种较单一[1]。

基围虾富含蛋白质、维生素、矿物质、烟酸等营养成分。市场上大基围虾以鲜售形式为主，而小基围虾常被当成下脚料丢弃或用于饲养家禽，造成环境污染及其营养价值的流失，使得小基围虾的经济效益受限[2]。虾调味料因其味道鲜美和营养丰富备受消费者喜爱，目前制备水产调味料的方法主要是通过酶解的方式水解蛋白质，提取其中的风味成分，然后经干燥技术制备调味料，其酶解方式大多数以单酶酶解的形式进行，然而单酶水解存在酶解周期长、酶解不充分、蛋白利用率低等问题[3]。为了进一步提升酶解效果，可采用其他方法联合酶解。

超声是一种绿色环保的新兴技术，通过超声对酶解工艺的辅助，可有效提高酶解效果[4]。但目前将超声辅助碱性蛋白酶作用于小基围虾的相关报道较少，利用小基围虾制备虾调味料的报道几乎没有。因此，本研究以小基围虾为原料，利用超声辅助碱性蛋白酶作用于小基围虾制备调味料基液，考察超声功率、超声时间和酶解时间对小基围虾的酶解效果，并利用响应面优化其工艺，在此基础上，结合美拉德反应和喷雾干燥技术制备虾调味料，旨在促进超声技术在食品加工中的应用，丰富水产品调味料的品种，提高小基围虾的利用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

小基围虾：购于钦州市东风市场。

1.2 试剂

碱性蛋白酶：上海源叶生物科技有限公司；乙醇、氢氧化钠、浓硫酸、柠檬酸、硫酸铜、硫酸钾、磷酸氢二钠、硼酸、葡萄糖、甲醛等：天津市大茂化学试剂厂。

1.3 主要仪器与设备

ST3100型酸度计 奥豪斯仪器（上海）有限公司；07060205型超声波细胞破碎仪 宁波普莱森特生物科技有限公司；Lumina荧光分光光度计 九方沃德（北京）科技发展有限公司；OM-1500A实验室小型喷雾干燥机 上海欧蒙实业有限公司；DZKW-S-4型恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 主要工艺流程

小基围虾→清洗→超声处理→加酶→调节pH→酶解反应→灭酶→离心→上清液→美拉德反应→喷雾干燥→调味料。

1.4.2 单因素实验

本课题组前期单独使用碱性蛋白酶进行实验，发现单独使用碱性蛋白酶的最佳作用条件为固液比1∶2、酶解pH 8.0、酶解温度60 ℃、加酶量2 500 U/g、酶解时间4.5 h。因此，除非特殊说明，以下超声辅助酶解实验固定固液比为1∶2、酶解pH为8.0、酶解温度为60 ℃、加酶量为2 500 U/g。

1.4.2.1 超声功率对酶解效果的影响

取一定量的虾，清洗后用粉碎机粉碎，按照固液比为1∶2加入适量的水，分别以超声功率200，250，300，350，400 W超声25 min，加酶量为2 500 U/g，调节pH为8.0，在60 ℃条件下恒温水浴4 h进行酶解反应，反应结束后测定酶解指标。

1.4.2.2 超声时间对酶解效果的影响

取一定量的虾，清洗后用粉碎机粉碎，按照固液比为1∶2加入适量的水，以超声功率300 W分别超声5，15，25，35，45 min，加酶量为2 500 U/g，调节pH为8.0，在60 ℃条件下恒温水浴4 h进行酶解反应，反应结束后测定酶解指标。

1.4.2.3 酶解时间对酶解效果的影响

取一定量的虾，清洗后用粉碎机粉碎，按照固液比为1∶2加入适量的水，以超声功率300 W超声25 min，加酶量为2 500 U/g，调节pH为8.0，在60 ℃条件下分别恒温水浴2.5，3.0，3.5，4.0，4.5 h进行酶解反应，反应结束后测定酶解指标。

1.4.3 响应面实验

根据Box-Behnken原理，结合单因素实验结果，确定响应面优化实验的因素水平，见表1。

1.4.4 虾调味料制备工艺

参考刘伟[5]的研究，综合考虑，确定反应条件为还原糖（葡萄糖∶木糖为1∶2）添加量3%、pH 6.0、温度115 ℃、时间90 min。参考赵兰等[6]对虾味调味料喷雾干燥工艺的研究，选择喷雾干燥工艺参数为进风温度190 ℃、热风流量35 m3/h、入料速率700 mL/h。

1.4.5 氨基酸态氮含量的测定

根据GB 5009.235—2016中的方法测定氨基酸态氮含量，量取已酶解上清液5 mL，用蒸馏水定容至100 mL，然后取混合液20 mL稀释至5倍。用0.05 mol/L 氢氧化钠标准溶液滴定，第一次滴定终点为pH 8.2，到达终点后加入10 mL无沉淀物的甲醛溶液，继续滴定直至pH为9.2即为终点，记录此时消耗的氢氧化钠滴定体积为 V1。以蒸馏水替代酶解液作为空白实验，空白时用去的氢氧化钠滴定液的体积记为 V2。 氨基酸态氮含量（AN）计算公式如下：

AN（%）=（V1－V2）×0.05×0.014 05×20100×100%。

1.4.6 蛋白质含量的测定

根据GB 5009.5—2016中的方法测定蛋白质含量，用10 g酶解上清液+0.4 g硫酸铜+6 g硫酸钾+20 mL硫酸消化，结束后静置冷却，然后加入50 mL蒸馏水，蒸馏并滴定，滴定至终点时读取盐酸的消耗体积，记为V1，以蒸馏水替代酶解液作为空白实验，空白时消耗的滴定液的体积记为V2。试样中蛋白质含量（N）按下式计算：

N（%）=（V1－V2）×1×0.014 010×V3100×F×100%。

式中：V3为吸取消化液的体积（mL），F为氮换算为蛋白质的系数。

1.4.7 水解度的测定

DH（%）=AN－AN0N×100%。

式中：DH、AN0、AN、N分别代表水解度（%）、基围虾水解前游离态氨基酸的含量（g/dL）、基围虾酶解后氨基酸态氮的含量（g/dL）、总氮含量（g/dL）。

1.4.8 氨基酸转化率的测定

氨基酸转化率（%）=ANN总×100%。

式中：AN为上清液中氨基酸态氮的含量（g/dL）；N总为上清液中总蛋白质的含量（g/dL）。

1.4.9 蛋白质转化率的测定

蛋白质利用率（%）=N总N0×100%。

式中：N总为上清液中总蛋白质含量（g/mL）；N0为酶解液中总蛋白质含量（g/mL）。

1.4.10 荧光光谱测定

使用pH 7.0的10 mmol/L磷酸盐缓冲液制备样品浓度为0.2 mg/mL的溶液，进行荧光光谱测定，设定参数：激发波长290 nm，范围300～460 nm，狭缝5 nm[7]。

1.4.11 营养成分的测定

水分含量：参照GB 5009.3—2016中规定的方法测定；脂肪含量：参照GB 5009.6—2016中规定的方法测定；蛋白质含量：参照GB 5009.5—2016中规定的方法测定；灰分含量：参照GB 5009.4—2016中规定的方法测定。

1.4.12 调味料感官评定

随机挑选8名同学（男女各半）进行感官评价，对其进行培训训练。调味料感官评价标准见表2。

1.4.13 调味料理化检测方法

1.4.13.1 干燥失重的测定

参照GB/T 8967—2007中的方法测定：用烘干至恒重的称量瓶称取试样5 g，在（105±1） ℃烘箱中干燥5 h，于干燥器中静置，冷却至室温，称量。干燥失重（X1）按下式计算：

X1（%）=m1－m2m1－m×100%。

式中：m1、m2、m、X1分别代表称量瓶的质量（g）、干燥前称量瓶和试样的质量（g）、干燥后称量瓶和试样的质量（g）、样品的干燥失重（%）。

1.4.13.2 氯化物含量的测定

参照GB/T 5009.39—2003中规定的方法测定。

1.4.13.3 总氮含量的测定

参照GB 5009.5—2016中规定的方法测定。

1.4.13.4 无机砷含量的测定

参考GB 5009.11—2014中规定的方法测定。

1.4.13.5 铅含量的测定

参考GB 5009.12—2017中规定的方法测定。

1.4.14 调味料微生物指标检测方法

菌落总数：参考 GB 4789.2—2016中规定的方法测定。

大肠菌群：参考GB 4789.3—2016中规定的方法测定。

致病菌金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌分别参考GB 4789.10—2016、GB 4789.5—2012、GB 4789.4—2016、GB 4789.7—2013中规定的方法测定。

1.4.15 数据处理与分析

每组做3次重复实验，实验结果用平均值±标准差表示，用SPSS软件分析单因素方差分析和Duncan多重比较分析结果；采用Desgin-Expert 8.0.6软件分析响应面；采用Origin软件制图。

2 结果与分析

2.1 小基围虾基本营养成分测定结果

评价水产品在膳食中的营养价值主要考评其七大营养成分，其中蛋白质成分具有增强人体免疫力、提供能量等作用，因而为了解小基围虾基本营养成分而测定其各种营养成分，结果见表3。

由表3可知，小基围虾富含营养成分，是一种高蛋白、低脂肪的海虾，其营养成分与其他海虾相近，具有较高的营养价值[8]。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 超声功率对酶解效果的影响

超声功率大小反映超声破碎空化作用的强度，超声波的空化作用产生的振荡与崩溃使蛋白质大分子结构损坏，从而促进酶解反应的进行。因此，考察超声功率对酶解效果的影响，结果见图1。

由图1可知，蛋白质利用率、氨基酸转化率和水解度均随着超声功率的增大（200～400 W）先增大后减小，300 W时酶解效果最好，对应的数值分别为

（72.73±1.52）%、（28.31±0.66）%、（21.61±0.54）%。造成以上现象归因于超声处理基围虾时空化效应随超声功率的逐渐增大而加强，这种效应是超声波的高频振动引起的，它在液体中形成了高压和低压的交替区域，导致液体中的气泡形成和崩溃，这些气泡的崩溃释放出巨大的能量，产生了剧烈的湍流和微小的喷射流，对底物蛋白质的空间构象产生了剪切力。通过超声处理对底物蛋白质的剪切作用，蛋白质颗粒逐渐细化，原本较大的蛋白质颗粒在超声波的作用下被分解成更小的颗粒，有利于增加酶与底物之间的接触面积。加之，超声处理还能够使蛋白质的结构发生变化，暴露更多的反应位点，使酶更容易与底物结合。由于蛋白质颗粒的细化和反应位点的增加，酶与底物之间的反应速率得到提高。酶能够更有效地与底物结合并催化化学反应的进行，从而加快反应速率。此外，由于底物颗粒的细化，反应物分子之间的扩散距离减小，有助于增加反应速率。随着酶促反应速率的提高，产物的生成速度也相应增加[9]。继续增大超声功率，氨基酸转化率和水解度均下降，这是因为底物蛋白进一步聚集，导致粒径增大，不利于酶解反应的进行，这一结果与熊喆等[10]所得结果相一致。因此，确定超声功率为300 W进行下一步实验。

2.2.2 超声时间对酶解效果的影响

超声时间对超声效果有影响，时间过长会导致酶活力受到抑制，时间过短会导致作用力不足，故而考察超声时间分别为5，15，25，35，45 min时对酶解效果的影响，结果见图2。

由图2可知，当超声时间由5 min增至45 min时，蛋白质利用率、氨基酸转化率和水解度呈现先显著上升后下降的变化趋势。在5～35 min时，随着超声时间的增加，这些指标逐渐上升。然而，当超声时间达到35 min时，这些指标均达到最高值，水解度为（22.25±0.03）%，氨基酸转化率为（28.28±0.04）%，蛋白质利用率为（80.81±0.87）%。超声处理对底物蛋白质的剪切作用和空化效应导致蛋白质颗粒的细化和更多反应位点的暴露，从而促进了酶催化的水解反应。因此，随着超声时间的增加，水解度、氨基酸转化率和蛋白质利用率均逐渐升高。当超声时间达到35 min时，这些指标均达到最高值，这可能是因为超声时间过长导致一些不利因素的产生。例如，超声波的剧烈振动和湍流效应可能会对酶的活性产生不利影响，或者超声处理过程中产生的热量可能导致酶失活。因此，超声时间超过35 min后，这些不利因素可能开始占据主导地位，导致水解度、氨基酸转化率和蛋白质利用率逐渐下降至趋于平缓 [11]，与Ma等[12]所得结果相一致。综合考虑，确定超声时间为35 min进行下一步实验。

2.2.3 酶解时间对酶解效果的影响

由图3可知，当酶解时间由2.5 h延长至4.5 h时，3项指标均呈现先上升后下降的趋势，4 h时均达到最高值，蛋白质利用率、氨基酸转化率、水解度分别为（80.81±0.87）%、（28.28±0.04）%、（22.25±0.03）%。造成以上现象的原因可能是超声破碎处理导致小基围虾的蛋白质结构失序，暴露出大量的酶结合位点，从而促进酶催化反应速率的提高，增加产物生成效率并缩短酶解时间 [13]。在上述条件下小基围虾酶解的蛋白质利用率、氨基酸转化率、水解度比未超声处理的3项指标均有所提高。可见，超声处理对酶促反应具有加快速率的作用，并提高了反应得率。综合考虑，确定酶解时间为4 h进行下一步实验。

2.3 响应面实验结果与分析

响应面实验结果见表4，水解度的方差分析见表5，对响应面结果进行数据分析，获得回归方程：Y=+23.49+0.73A+1.68B+0.42C+0.38AB+0.25AC－0.65BC－1.23A2－1.63B2－1.71C2。

结果显示，方程的拟合性良好，其R2值为0.986 0，表明该方程能够较好地拟合实验数据并具有较小的误差。此外，校正系数RAdj2为0.876 6，表明该方程能够解释超过80%的实验数据的变异性。

由表5可知，F值为54.80，P值lt;0.000 1，表明该模型具有极显著性，即该模型在解释因变量上的变异方面具有显著性。此外，失拟项的P值为0.377 8（gt;0.05），说明该模型失拟项不显著，即模型的预测值与实测值之间没有显著差异。结合变异系数1.27%，说明利用此模型预测获得的结果相对稳定。因此，可利用此回归方程对超声辅助碱性蛋白酶对小基围虾酶解反应的水解度进行预测。各项因素中，一次项A、B极显著，C显著；交互项BC极显著，而AB、AC的显著性低；二次项A2、B2、C2均极显著。根据分析结果可以得出以下结论：在影响水解度的因素中，超声功率对水解度的影响最显著，其次是超声时间，而酶解时间对水解度的影响相对较小。

响应曲面的弧度表示因素对响应值的影响程度，弧度越接近椭圆表明影响越大[14]。

比较图4中响应曲面弧度可知，对小基围虾水解度影响最大的是超声功率。相比之下，其他因素的弧度比较小，说明它们对水解度的影响相对较小。

由回归模型得出最优超声辅助酶处理条件为超声功率326.05 W、超时时间37.89 min、酶解时间3.99 h，其水解度最大可达24.09%。结合实际操作处理情况对条件进行修正，通过回归模型得出的最优超声辅助碱性蛋白酶处理小基围虾的条件为超声功率326.05 W、超声时间37.89 min、酶解时间3.99 h，水解度最大为24.09%。结合超声设备实际情况，对回归模型得出的参数进行修正，得出超声功率、超声时间、酶解时间分别为326 W、38 min、4 h，在此条件下水解度为（24.84±0.52）%，比未超声处理单独使用碱性蛋白酶作用提高了9.48%。

2.4 酶解液荧光光谱分析

荧光光谱测定是一种用于了解大分子结构的方法，通过检测样品中大分子的荧光发色团来推断其分子结构。在蛋白质中，内部的荧光基团会在紫外线照射下发出荧光，这种荧光的强度和发射波长主要受到蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的极性以及两者之间相互作用的影响[15]。因此，通过观察荧光强度的变化，可以判断蛋白质的三级结构是否发生了改变[16]。对超声与未超声处理的小基围虾酶解液进行荧光光谱扫描，结果见图5。

由图5可知，在相同的波长下，经过超声处理和未经超声处理的酶解液荧光光谱都显示出吸收峰，表明超声辅助并没有导致荧光峰位的移动。然而，经过超声处理的酶解液荧光光谱的吸收峰明显高于未经超声处理的酶解液，这是因为超声处理破坏了小基围虾的蛋白质结构，增加了荧光基团的释放量。因此，在相同的吸收峰位置上，经过超声处理的酶解液显示出更强的荧光强度。通过观察荧光强度的变化可以得出：超声波破碎处理有利于改变小基围虾酶解液中蛋白质的空间构象，导致荧光基团大量释放，从而提高了酶解效果。

2.5 调味料质量分析

2.5.1 营养成分及感官评价结果与分析

由表6可知，小基围虾超声辅助酶解后经过美拉德反应和喷雾干燥后所得产品具有海鲜的鲜味，色泽较好，组织形态细腻均匀。其营养成分蛋白质含量高，脂肪含量低，符合目前消费者所追求的绿色、健康、天然及富含营养的食品调味料。

2.5.2 理化指标和微生物指标结果与分析

由表7可知，小基围虾调味料的理化指标和微生物指标均符合商业标准SB/T 10485—2008《海鲜粉调味料》的相关要求，表明该调味料可以满足消费者对产品质量和安全性的需求。

3 结论

建立超声辅助碱性蛋白酶酶解小基围虾数学模型：Y=+23.49+0.73A+1.68B+0.42C+0.38AB+0.25AC－0.65BC－1.23A2－1.63B2－1.71C2 。确定超声辅助酶解技术最优条件为超声功率326 W、超声时间38 min、酶解时间4 h，在此条件下小基围虾酶解液水解度为（23.84±0.52）%，比未超声处理单独使用碱性蛋白酶作用提高了9.48%，揭示其原因是超声处理改变了蛋白质的空间构象，使得反应底物能更快地与酶结合。在此基础上制备的小基围虾调味料符合商业标准SB/T 10485—2008《海鲜粉调味料》相关要求且符合目前消费者所追求的绿色、健康、天然及富含营养的食品调味料。

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