带鱼酶解工艺研究及海鲜调味汁的制备

摘要：文章以带鱼为研究对象，通过酶解作用制备海鲜调味汁。以水解度（DH）为评价指标，研究了不同种类的蛋白酶对酶解效果的影响，并通过正交试验对酶解工艺参数进行优化，确定最佳工艺条件。结果表明，风味蛋白酶和中性蛋白酶的酶解效果较好。最佳工艺条件为酶解温度60 ℃、复配比例2∶1、酶添加量1 000 U/g底物、酶解时间3.5 h。利用酶解液制备的海鲜调味汁中必需氨基酸和鲜味氨基酸含量较高，带鱼香味浓郁，鲜香味明显，无明显杂质，有作为具有特色风味的调味汁的潜力。

关键词：带鱼；酶解作用；工艺；正交试验；海鲜调味汁

中图分类号：TS201.1 """""文献标志码：A """"文章编号：1000-9973（2024）09-0109-05

Study on Enzymatic Hydrolysis Process of Hairtail and

Preparation of Seafood Sauce

WANG Ran1， FENG Xin-rui1， FAN Wen2， WU Tao-an1，

ZHANG Bao1， ZHOU Hui1， CAI Ke-zhou1*

（1.Key Laboratory of Green Manufacturing and Resource Exploration of Animal-derived Food

in Anhui Province， Hefei University of Technology， Hefei 230009， China; 2.Zhengzhou

Synear Food Co.， Ltd.， Zhengzhou 450003， China）

Abstract： In this paper， with hairtail as the research object， seafood sauce is prepared through" enzymatic hydrolysis. With the degree of hydrolysis （DH） as the evaluation index， the effects of different types of proteases on the enzymatic hydrolysis effect are studied， and enzymatic hydrolysis process parameters are optimized through orthogonal test， in order to determine the optimal process conditions. The results indicate that flavor protease and neutral protease have better enzymatic hydrolysis effects. The optimal process conditions are enzymatic hydrolysis temperature of 60 ℃， compound ratio of 2∶1， enzyme addition amount of 1 000 U/g substrate and enzymatic hydrolysis time of 3.5 h. The seafood sauce prepared using the enzymatic hydrolysate has higher content of essential amino acids and umami amino acids. The sauce has rich hairtail aroma， clear umami aroma and no obvious impurities， indicating that it has potential as sauce with characteristic flavor.

Key words： hairtail; enzymatic hydrolysis; process; orthogonal test; seafood sauce

收稿日期：2024-03-07

基金项目：“十四五”国家重点研发计划课题（2021YFD21002）

作者简介：王冉（1998—），女，硕士，研究方向：食品现代加工理论与方法。

*通信作者：蔡克周（1980—），男，教授，博士，研究方向：肉品加工与质量控制。

中国是世界上最大的带鱼生产国之一，中国各个沿海省份都有着丰富的带鱼资源[1]。带鱼种类繁多，作为我国重要的鱼类之一，其肉质细嫩，深受消费者的喜爱。带鱼是一种蛋白质含量（17.57%）和脂肪含量（5.16%）较高的鱼类，同时还含有多种人体所需的营养成分，例如矿物质、维生素、不饱和脂肪酸等[2-3]。然而，长期以来，由于带鱼市场价格低，加工技术水平和回收手段落后，滞销的带鱼大多仅用于加工生产饲料、鱼粉等，导致产品的利用率不高、经济效益低，并且存在严重的资源浪费等现象[4-6]。因此，如何提高带鱼的附加值和资源利用率已成为现在研究的热点之一，开展此类研究能够为带鱼的深度利用提供理论基础和参考依据。

目前，海鲜调味料作为一种特有的风味调料制品，已经成为人们餐桌上不可或缺的调味品之一[7]。制备海鲜调味料的方法主要包括酶解法和微生物发酵法[8-10]。其中，利用酶解法制备海鲜调味汁已经得到广泛的应用和研究。Peinado等[6]发现酶解后的鱼粉释放出大量的呈味氨基酸，尤其是谷氨酸、赖氨酸。Zhang等[11]发现酶解海带后制备的海鲜调味品中含有丰富的氨基酸，主要呈现鲜味和咸味，这些结果表明酶解法在海鲜调味制品的制备中具有较大的潜力。目前，国内外对带鱼的研究多集中在生物活性肽、金属螯合物等方面，而以带鱼为原料制备调味汁的报道较少。因此，本研究旨在通过酶解法制备具有带鱼特色风味的海鲜调味汁，以提高带鱼的深加工利用价值并为新型海鲜调味品的开发提供一定的技术依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

冰鲜带鱼：购于合肥大润发超市翡翠店；风味蛋白酶（2×104 U/g）、碱性蛋白酶（2×105 U/g）、中性蛋白酶（5×104 U/g）、复合蛋白酶（1.2×105 U/g）：上海源叶生物科技有限公司；邻苯二甲醛（分析纯）：上海毕得医药科技股份有限公司；十二烷基硫酸钠（SDS，分析纯）：上海科雅生物科技有限公司；二硫苏糖醇（DTT，分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；L-丝氨酸（分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；四硼酸钠、无水乙醇（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

T18型高速均质机 德国IKA集团；HC-3018R高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；Synergy H1型酶标仪 美国BioTek仪器有限公司；SZCL-2恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司；SB-5200D超声波清洗机、Scientz-12N冷冻干燥机 宁波新芝生物科技有限公司；HH-4X型恒温水浴锅 上海力辰邦西仪器科技有限公司；S-433D全自动氨基酸分析仪 德国Sykam公司。

1.3 试验方法

1.3.1 带鱼酶解液的制备

将带鱼进行预处理，去除鱼骨、鱼鳍、内脏等，清洗干净，沥干水分后，分装并密封于－20 ℃冰箱中保存备用。

工艺流程：向预处理后的带鱼肉中按一定的料液比（1∶5）加入超纯水，混合均匀后，经8 500 r/min均质匀浆2 min后，添加适量的蛋白酶，在一定温度下进行酶解；酶解结束后，于80～90 ℃水浴锅中灭酶10～15 min，冷却后，在4 ℃、8 000 r/min的条件下离心15 min，弃沉淀，即为待测酶解液。

1.3.2 蛋白酶的筛选

选取风味蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶，料液比为1∶5，酶添加量为400 U/g底物，于各自最适条件下进行酶解。以水解度（DH）为筛选指标，筛选出两种效果最佳的蛋白酶进行后续酶解条件优化试验。

1.3.3 单因素试验设计

以酶解液的水解度为指标，在保证其他因素相同的情况下，考察酶解时间（2.5，3，3.5，4，4.5 h）、酶解温度（40，45，50，55，60 ℃）、酶添加量（400，600，800，1 000，1 200 U/g底物）、复配比例（3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）4个因素对酶解液水解度的影响，进而筛选出最佳条件。

1.3.4 正交试验设计

在单因素试验的基础上，研究风味蛋白酶和中性蛋白酶的酶解温度、复配比例、酶添加量、酶解时间对酶解效果的影响，以水解度为指标，进行四因素三水平L9（34）正交试验，进一步确定最佳水解工艺条件，正交试验因素及水平设计见表1。

1.3.5 水解度（DH）

水解度（degree of hydrolysis，DH）是指蛋白质中肽键被酶裂解的百分比，可用来衡量蛋白质被酶解的程度。以丝氨酸作为标准品，采用OPA法对带鱼酶解液进行水解度的测定[12-13]。水解度（DH）计算公式如下：

DH=Serine-NH2-βα·htot×100%。

式中：Serine-NH2为每克蛋白中丝氨酸氨基的毫摩尔数（mmol/g）；htot为每克蛋白中所含的总肽键数（mmol/g），带鱼的htot为8.17 mmol/g[14]；α、β分别为常数1，0.4[12]。

1.3.6 带鱼海鲜调味汁的制备

在酶解液中加入1％白砂糖、1.5％食用盐、0.5％味精、0.2％柠檬酸进行调配。将加入辅料的酶解液混合均匀，即为带鱼海鲜调味汁。

1.3.7 游离氨基酸的测定

对海鲜调味汁进行游离氨基酸含量的测定，测定方法参考GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》。

1.3.8 感官评价

感官评定小组由6名食品质量与安全和食品科学与工程专业的学生组成，其中男生3名，女生3名，年龄均在22～26岁。在正式参与评价前，6名感官评定人员分别对样品的肉香味、甜味、鲜味、咸味、苦味等进行了训练以区分不同的味道和特征。每次评价之前漱口30 s，随后在昏暗的条件下进行感官描述。

1.4 数据统计

所有数据均平行3次，结果表示为平均值±标准差。运用统计软件Origin 8.0、SPSS 26.0进行数据的处理和分析，显著性水平为Plt;0.05。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶的筛选

本研究选取了4种蛋白酶，包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶和复合蛋白酶。以丝氨酸做标准曲线，见图1。测定了不同蛋白酶酶解带鱼后酶解液的水解度（DH），结果见图2。

由图2可知，不同蛋白酶对带鱼的酶解效果有显著差异。风味蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶对应的水解度依次为20.59%、10.73%、6.84%、11.17%，其中风味蛋白酶水解带鱼蛋白的能力最强，表明经过风味蛋白酶的酶解作用，更多的小分子物质如多肽被释放出来[15]。风味蛋白酶的酶解效果最强，说明风味蛋白酶可能更适合酶解带鱼蛋白，其次是中性蛋白酶和复合蛋白酶。因此，选择风味蛋白酶和中性蛋白酶作为酶解带鱼的最适蛋白酶。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 复配比例对酶解效果的影响

复配比例（风味蛋白酶∶中性蛋白酶）对带鱼酶解效果的影响见图3。

由图3可知，随着风味蛋白酶比例的减小，水解度呈现先上升后下降的趋势。当中性蛋白酶的比例不断增大时，水解度呈现相同的变化趋势。在复配比例为2∶1（风味蛋白酶∶中性蛋白酶）时，水解度达到峰值（32.53%），这是由于蛋白酶的酶切位点不同，不同的酶复配有助于起到互补的效果，进而促进肽键的断裂和短肽的生成，水解度升高[16]。因此，选择2∶1作为酶解的最适复配比例。

2.2.2 酶添加量对酶解效果的影响

酶添加量对酶解效果的影响见图4。

由图4可知，随着酶添加量的增加，水解度整体呈现先上升后下降的趋势。当酶添加量从400 U/g底物增加到1 000 U/g底物时，水解度显著上升，当酶添加量为1 000 U/g底物时，水解度达到最大值，为32.91%。而当酶添加量超过1 000 U/g底物时，水解度呈现下降趋势，这可能是由于酶添加量过多导致酶解物进一步分解。因此，选择1 000 U/g底物为最佳酶添加量。

2.2.3 酶解时间对酶解效果的影响

酶解时间对酶解效果的影响见图5。

由图5可知，随着酶解时间的延长，水解度呈现先升高后降低的趋势。当酶解时间从2.5 h增加到3 h时，带鱼蛋白的水解度逐渐上升，从27.62%上升到32.69%，达到最大值。当酶解时间从3 h延长到4.5 h时，水解度逐渐降低，从32.69%降低至27.44%，并且下降的速度逐渐缓慢，这可能是因为短时间内酶与底物充分结合，使得水解度升高，而时间过长，底物逐渐减少，酶与底物结合时可能会产生竞争性抑制作用，从而导致水解度呈现下降趋势[17]。因此，选择3 h作为最佳酶解时间。

2.2.4 酶解温度对酶解效果的影响

酶解温度对酶解效果的影响见图6。

由图6可知，随着酶解温度的升高，水解度逐渐升高；当酶解温度达到55 ℃时，水解度达到最大值，为36.85%。当酶解温度超过55 ℃后，水解度下降，这可能是因为酶解温度过高抑制了酶的生物活性，从而降低了对底物的水解能力。因此，选择55 ℃作为最适酶解温度。

2.3 正交试验结果

在单因素试验的基础上，选取酶解温度、复配比例、酶添加量、酶解时间4个因素，取各单因素试验中3个较优水平，按照表1进行正交试验，正交试验方案设计与结果见表2，方差分析结果见表3。

由表2中极差分析可知，对带鱼酶解效果影响的因素主次顺序为酶解温度gt;酶添加量gt;酶解时间gt;复配比例。由表3中方差分析可知，酶解温度和酶添加量对酶解效果的影响极显著，而复配比例和酶解时间对酶解效果的影响显著。表2中第9号试验结果最好，其最优组合为A3B3C2D1。而根据计算分析可得最优组合为A3B2C2D3。在A3B2C2D3条件下测得的水解度为42.39%。因此，采用酶添加量1 000 U/g底物、复配比例（风味蛋白酶∶中性蛋白酶）2∶1、酶解温度60 ℃、酶解时间3.5 h作为反应条件制备酶解液。

2.4 海鲜调味品综合评价

2.4.1 游离氨基酸组成和含量分析

游离氨基酸对酶解产物的风味特性具有重要影响[18]。海鲜调味汁中游离氨基酸的组成和含量见表4。

由表4可知，酶解液中主要的氨基酸为谷氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和精氨酸。必需氨基酸（Lys、Phe、Met、Thr、Ile、Val、His、Leu）含量占58.59%，占比较高。在必需氨基酸中，亮氨酸含量最高，为（4.47±0.01） g/100 g，其次是苯丙氨酸，含量为（3.15±0.02） g/100 g。鲜味氨基酸（Glu、Asp）占比为12.08%，其中谷氨酸含量为（3.00±0.04） g/100 g，仅次于异亮氨酸、亮氨酸和精氨酸，并且鲜味氨基酸含量高，有助于促进产品鲜味的产生，为成品提供鲜香风味。

2.4.2 感官评价

由表5可知，经过感官评价后，发现利用酶解液制备的海鲜调味汁呈现浓郁的带鱼香味，鲜味和咸味较明显，其次是甜味，苦味较弱。观察形态发现，无沉淀、不溶物存在，且颜色鲜亮有光泽。因此，上述结果表明采用优化后的工艺制备的酶解液有作为海鲜风味调味汁的潜力。

3 结论

本文以水解度作为筛选指标，通过试验筛选出酶解带鱼的两种最优酶（风味蛋白酶和中性蛋白酶），并运用单因素试验、正交试验确定了带鱼酶解液制备的最佳工艺条件：酶解温度60 ℃、复配比例2∶1、酶添加量1 000 U/g底物、酶解时间3.5 h，此条件下酶解液的水解度达到42.39%。经过游离氨基酸测定发现，利用最优条件下得到的酶解液制成的海鲜调味汁中鲜味氨基酸含量较高，其中谷氨酸含量仅次于异亮氨酸、亮氨酸和精氨酸。必需氨基酸含量占比58.59%，营养价值较高。感官评价结果显示，调味汁咸鲜味适中，具有带鱼特有的香气，无刺激性味道，无肉眼可见的杂质。该研究结果为提高带鱼的深加工提供了参考，也为酶解制备海鲜调味汁这一思路提供了理论依据。

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