不同醋酸菌对菠萝糯米果粮醋风味的影响

摘要：为探究不同醋酸菌对菠萝糯米果粮醋醋酸发酵过程和风味的影响，该研究分析了醋酸发酵过程中菌落总数、温度、总酸、不挥发酸的变化和醋液有机酸含量与挥发性成分。结果表明，与沪酿1.01相比，醋酸菌DHC23能更快适应高乙醇环境，同时能耐受更高的温度；上醅醋酸菌DHC23菌落总数峰值为1.52×108 CFU/g，而沪酿1.01仅为1.95×107 CFU/g；由于翻醅，醅温呈现周期性升降变化，前者峰值为42.1 ℃，后者仅为40.2 ℃。两组醋醅总酸含量均逐渐增加，不挥发酸含量均先上升后缓慢下降，而醋酸菌DHC23更有利于总酸和不挥发酸含量的提升，且使发酵时间缩短1 d。DHC23组醋液中乙酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸、酒石酸和焦谷氨酸含量均比沪酿1.01组含量高，且差异显著。两组醋液挥发性成分种类差异不显著，但醋酸菌DHC23有利于醛类、酸类、酯类和吡嗪类物质的生成。

关键词：糯米；菠萝；醋；醋酸菌；风味

中图分类号：TS264.22 """""文献标志码：A """"文章编号：1000-9973（2024）09-0009-06

Effect of Different Acetic Acid Bacteria on Flavor of

Pineapple-Glutinous Rice Fruit Grain Vinegar

QI Yong-gang1，2， DONG Hong-bing3， CAI Feng-jiao1， GU Yun2， GONG Yuan-yuan2，

HU Yong1， WU Qian1， HU Dong-bin4， WANG Chao1*

（1.School of Life and Health Sciences， Hubei University of Technology， Wuhan 430068， China;

2.Wuhan Xinhong Institute for Food Fermentation， Wuhan 430051， China; 3.College of Food

Science and Technology， Wuhan Business University， Wuhan 430056， China;

4.Zhenjiang Danhe Vinegar Industry Co.， Ltd.， Zhenjiang 212362， China）

Abstract： In order to study the effect of different acetic acid bacteria on the acetic acid fermentation process and flavor of pineapple-glutinous rice fruit grain vinegar， in this study， the changes of total bacterial count， temperature， total acid， non-volatile acid during the acetic acid fermentation and the content of organic acids and volatile components in vinegar are analyzed. The results show that compared with Shanghai Brewing 1.01， Acetobacter DHC23 can adapt to high ethanol environment more quickly and can tolerate higher temperature. The peak value of total bacterial count of Acetobacter DHC23 in the upper mash is 1.52×108 CFU/g， while that of Shanghai Brewing 1.01 is only 1.95×107 CFU/g. Due to flipping the mash， the temperature of the mash shows periodic fluctuations， with the former peak value at 42.1 ℃ and the latter only at 40.2 ℃. The total acid content of both groups of mashes gradually increases， while the non-volatile acid content firstly increases and then slowly decreases. Acetobacter DHC23 is more conducive to the improvement of the content of total acid and non-volatile acid， and shortens the fermentation time by 1 d. The content of acetic acid， lactic acid， citric acid， succinic acid， tartaric acid and pyroglutamic acid in DHC23 group vinegar is higher than that in Shanghai Brewing 1.01 group， and the difference is significant. There is no significant difference in the types of volatile components between

them， but Acetobacter DHC23 is beneficial to the generation of aldehydes， acids， esters and pyrazines.

Key words： glutinous rice; pineapple; vinegar; acetic acid bacteria; flavor

收稿日期：2024-05-10

基金项目：中国高校产学研创新基金项目（2022BL024）；国家自然科学基金面上项目（32272299）；湖北省重点研发计划项目（2021BBA073）

作者简介：祁勇刚（1983—），男，硕士，研究方向：食品发酵。

*通信作者：汪超（1978—），男，教授，博士，研究方向：食品酿造。

镇江香醋是江苏镇江地域的传统地方特色食醋[1]，是我国四大名醋之一。它以糯米为主要原料，以麦麸和稻糠为辅料，采用固态分层翻醅醋酸发酵等多道工序酿制而成[2-4]，具有酸味柔和、香气浓郁、口感微甜、色泽清亮的特点[5]。由于镇江属亚热带季风气候，四季分明，温度波动大，醋的品质也会随之发生变化[6-7]，由于食醋的开放式发酵方式，当夏季醋醅温度高于37 ℃时，醋醅中醋酸菌不能正常成为优势菌，醋醅中芽孢杆菌容易大量增殖而使醋醅变质，且不易发现，倒缸容易使同周期的醋醅全部变质，造成重大经济损失。因此，筛选耐高温、耐乙醇的醋酸菌以快速适应夏季的高温环境和醋醅的初始高酒精度[8-9]，不仅可以提升食醋的品质[10-11]，而且能保障醋酸发酵全年正常进行，最大程度地降低经济损失。

食醋作为我国必备酸性调味品之一，既可以调味，又可以饮用，为了提升其酸味柔和性和香气，可以选用谷物与水果为原料，酿造复合香型果粮醋[12-14]。菠萝（Ananas comosus）是我国产量最大和最畅销的热带水果之一，肉质脆嫩、甘甜多汁，是一种季节性很强的水果[15]，每年大量上市时易积压滞销，造成资源浪费。

本研究以菠萝和糯米为原料，采用镇江香醋分层翻醅醋酸发酵工艺，对比耐高温、高耐乙醇醋酸菌与沪酿1.01对醋酸发酵过程和食醋风味的影响，以期制备一种兼具菠萝和糯米香醋风味的复合香型果粮醋，为以菠萝和糯米为原料制备果粮醋市场化提供了理论参考。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料与菌种

菠萝：购自超市，糖酸比适宜；糯米、醋酸菌（Acetobacter pasteurianus HN1.01）沪酿1.01：由镇江丹和醋业有限公司提供；乳酸菌（Lactobacillus plantarum）DHR17、醋酸菌（Acetobacter aceti）DHC23：均为湖北工业大学食品酿造菌种库经丹和醋业醋醅分离筛选获得。

1.1.2 试剂

耐高温α-淀粉酶（5 000 U/g）、糖化酶（80 000 U/g）：上海麦克林生化科技股份有限公司；氯化钠、葡萄糖、吐温80、氢氧化钠、酵母膏、硫酸镁、无水乙醇（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；乙酸、琥珀酸、草酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、焦谷氨酸、苹果酸（均为色谱纯）：美国Sigma公司；果胶酶（600 U/mg）：上海源叶生物科技有限公司。

1.2 主要仪器与设备

MSF-S-50L控温机械搅拌发酵罐 南京汇科生物工程设备有限公司；1260 Infinity Ⅰ高效液相色谱仪、Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、7890B-5977B气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司；SPME手动进样器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头 美国Supelco公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菠萝糯米果粮醋工艺流程及操作要点

1.3.1.1 菠萝糯米果粮醋工艺流程

1.3.1.2 操作要点

菠萝酶解液：将菠萝清洗、去皮，用榨汁机破碎、榨汁，于35 ℃保温，加入0.6%果胶酶，酶解3 h，制备菠萝酶解液。

糯米糖化醪：将糯米加入机械搅拌罐中，以1∶4的质量比加入生活饮用水，加热至100 ℃，常压蒸煮20 min，而后保持温度90～92 ℃，加入0.04%耐高温的α-淀粉酶，保温约15 min至液化完全，然后快速降温至65 ℃，加入0.5%糖化酶，62～65 ℃保温酶解5 h，制备糯米糖化醪。

搅拌调配：将菠萝酶解液和糯米糖化醪以1∶1的质量比混合，搅拌均匀。

酒精发酵：取含有1.0%混合醪液的酿酒高活性干酵母，在2%的葡萄糖水中37 ℃活化20 min，加入醪液中，搅拌均匀，保持温度31 ℃发酵，至酒精度不再增大时酒精发酵结束，陈酿2 d得到酒醪。

醋酸发酵及封醅：模拟丹和醋业镇江香醋醋酸发酵工艺，自制10 L发酵缸，分别取酒醪5 kg和麸皮2.6 kg，加入发酵缸中，拌和均匀，加入乳酸菌种子液50 mL和30 ℃饮用水，使发酵缸含水量为60%，室温控制为25 ℃。加入120 g稻壳和30 mL摇瓶培养20 h的醋酸菌种子液，与醅料的1/10混合均匀，分为两组，接种醋酸菌分别为沪酿1.01和DHC23，每组5个发酵缸，其中每组留一空缸用于倒醅料。以发酵开始计时，每天定时翻醅，翻拌醅料1/10和向下的1/10，再添加120 g稻壳，拌和均匀。以后依次操作，再向下翻拌1/10的醅料，并添加120 g稻壳，拌和均匀，10 d后，直至全部醅料翻拌完成，翻拌过的醅料称为上醅，未翻拌的称为下醅，此阶段为过杓，直至醅料全部翻拌见底，称为露底。而后每天定时翻缸，将一缸醋醅全部倒入另一缸，第2天再次倒缸，直至总酸不再升高，发酵结束。加食用盐70 g，压实醋醅封缸[16-17]。

淋醋和蒸煮：醋汁直接由缸底出口流出，称为醋液。澄清后，加热煮沸，密封陈酿。

1.3.2 醋酸菌和乳酸菌计数

从发酵开始计时，每隔12 h取醋醅5.0 g，加入10.0 mL蒸馏水，振荡1 min，取1 mL涂布在醋酸菌琼脂培养基上培养24 h，观察醋酸菌菌落形态（灰白色圆形，边缘整齐，明显透明圈），计数[18]。

从发酵开始计时，每隔12 h取上层醋醅（简称上醅）5.0 g，加入10.0 mL蒸馏水，振荡1 min，取1 mL涂布在MRS琼脂培养基上培养24 h，观察乳酸菌菌落形态（直径约3 mm，凸起，呈圆形，表面光滑，细密，乳白色），计数。

1.3.3 醋醅温度测定

将温度计插入醋醅上醅和下醅指定位置，从发酵开始计时，每隔3 h读取温度值。

1.3.4 总酸和不挥发酸的测定

总酸和不挥发酸的测定参考GB/T 18623—2011《地理标志产品 镇江香醋》中的方法[19-20]。

1.3.5 有机酸的测定

参考许文琪等[21]的有机酸测定方法，同时参考GB/T 18623—2011《地理标志产品 镇江香醋》中有机酸的测定方法。采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）进行有机酸的测定，取淋醋后的醋液5 mL，选用0.22 μm滤膜过滤。色谱条件：检测波长为UV 210 nm，流动相为磷酸二氢钾（pH 2.4）100%，进样量10 μL，流速0.4 mL/min，柱温28 ℃。

1.3.6 挥发性风味成分的测定

取10 mL淋醋后的醋液放置于50 mL的顶空瓶中，磁力搅拌水浴锅60 ℃保温，将萃取头插入顶空瓶中，先平衡20 min，再推出吸附萃取头顶空吸附70 min，插入气相色谱仪进样口，解吸5 min。

色谱条件：载气为高纯氦气（99.999%），恒定流速1 mL/min，DB-WAX毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），进样口温度250 ℃，不分流进样模式；升温程序设置：温度40 ℃，保持2 min，以4 ℃/min升温至100 ℃，保持3 min，再以8 ℃/min升温至180 ℃，保持2 min，再以25 ℃/min升温至255 ℃。

质谱条件：电离方式：电子电离（electron ionization， EI）源，电子能量70 eV，四极杆温度150 ℃，传输线温度280 ℃，扫描质量范围：20～550 amu，接口温度250 ℃，离子源温度230 ℃。

1.3.7 数据处理

采用SPSS 26.0对数据进行显著性分析（Plt;0.05），采用Origin 2021进行折线图的制作。

2 结果与分析

2.1 醋醅菌落总数的变化

醋酸菌和乳酸菌是我国传统食醋发酵中产酸的微生物，而镇江香醋采用分层翻醅的方式发酵。由图1可知，在过杓阶段，接种的醋酸菌沪酿1.01菌落总数先急剧下降，再逐渐上升到最大值，而后又逐渐降低。接种醋酸菌DHC23与沪酿1.01的变化趋势一致。沪酿1.01菌落总数由初始的4.1×107 CFU/g迅速降低为1.05×105 CFU/g，发酵36 h时逐渐上升，至144 h时菌落总数达到峰值1.95×107 CFU/g；DHC23则由初始的4.0×107 CFU/g迅速降低为5.0×105 CFU/g，发酵24 h时开始逐渐上升，发酵120 h时菌落总数最大，为1.52×108 CFU/g。发酵初始，可能是醋醅温度低且酒精度高，醋酸菌生长受到抑制，甚至死亡，而经过一段时间的适应后，两组醋醅中醋酸菌开始代谢增殖，而由于醋酸菌DHC23较强的耐乙醇特性，其能更快地适应高乙醇环境，并较沪酿1.01更早开始增殖。

与醋酸菌相比，乳酸菌显示出了较强的环境适应能力，在发酵24 h时逐渐增长，沪酿1.01组乳酸菌在发酵120 h时达到峰值1.25×109 CFU/g，而后逐渐下降；DHC23组乳酸菌在发酵96 h时达到峰值2.5×109 CFU/g，可能是由于醋酸菌DHC23高耐乙醇特性和更高的菌落总数，使醋醅中酒精度较沪酿1.01组更早降低，进而促进了乳酸菌的代谢增殖，从而使其菌落总数提前1 d达到峰值。随着发酵的进行，由于受到醋醅酸度不断上升、底物不断消耗等环境因素的影响，乳酸菌、醋酸菌的菌落总数均缓慢下降。

醋酸发酵进入露底阶段，醋酸菌和乳酸菌菌落总数的变化见图2，两组醋醅中醋酸菌菌落总数均缓慢降低，DHC23组较沪酿1.01组提前1 d达到醋酸发酵终点，且DHC23菌落总数始终大于沪酿1.01，说明DHC23比沪酿1.01耐酸能力更强；随着发酵的进行，两组乳酸菌的菌落总数缓慢降低，至露底发酵第3天时，其菌落总数及变化趋势趋于一致。由于露底阶段进行彻底翻醅，醋醅具有更高的氧气含量，更有利于发酵的进行，但总酸含量的逐渐升高会进一步抑制醋酸菌和乳酸菌代谢增殖，进而使其菌落总数降低。

2.2 醋醅温度的变化

醋醅温度的变化与微生物代谢、环境温度和翻醅操作密切相关，是微生物代谢活动是否旺盛的宏观表现。在过杓阶段醋醅温度的变化见图3，整体上呈现出先陡升而后缓升缓降再陡降的周期性循环规律，这与樊苏皖[5]的研究结果一致；沪酿1.01组醋醅6 h时开始升温，至18 h时升至31.1 ℃，发酵24 h时测温后翻醅，27 h时温度迅速降低为26.6 ℃，而后3个升温周期温度峰值逐渐升高，发酵90 h时最高，为40.2 ℃，而后稳中有降，温度在26～40 ℃之间波动。DHC23组醋醅变化趋势与沪酿1.01组一致，但每个周期的温度峰值均比其高，最大峰值为42.1 ℃。发酵起始阶段，由于酒精度较高，抑制微生物的增殖，而后随着发酵进行，酒精度降低，微生物代谢活动更活跃，醋醅温度峰值攀升至40 ℃以上。

由图4可知，在露底阶段，醋醅温度随着翻醅的进行仍呈现有规律的周期性变化，两组变化周期温度峰值均先升高后缓慢降低，DHC23组温度峰值比沪酿1.01组高，至露底阶段第159 h时温度峰值比沪酿1.01组低，至发酵168 h时发酵终止，温度降低至封醅时的28.4 ℃，此阶段DHC23组与沪酿1.01组醋醅温度区间分别为27.1～42.3 ℃和27.1～40.2 ℃。由于整体翻醅，醋醅空气含量较过杓阶段更高，更有利于醋酸菌的代谢，温度峰值也较过杓阶段高，同时，产酸速率增大，总酸含量的升高会抑制微生物的代谢，加上营养物质的消耗，进而造成温度持续下降。

由于过杓阶段分层翻醅自上而下进行，下醅取样会影响醋酸发酵的正常进行，因此此阶段未对下醅的乳酸菌菌落总数进行测定，但温度可通过温度计直接读数，不影响发酵的进行。下醅温度变化见图5，两组醋醅温度均是先从26 ℃上升，而后稳定在30 ℃，最后下降至29.3 ℃，变化趋势一致，发酵温度也接近。由于下醅未进行翻醅，乳酸菌在发酵开始的有氧环境中会代谢增殖，菌落总数增大，氧气耗尽后，代谢活动旺盛，开始产乳酸等有机酸，醋醅温度升高并保持稳定，稍有波动，过杓后期可能是由于随着营养物质的消耗，乳酸菌代谢受到抑制，温度开始下降。

2.3 醋醅总酸和不挥发酸的变化

总酸是食醋中包括有机酸在内的各种酸类物质的总称，是醋酸发酵过程中一个重要的风味指标，醋醅中醋酸菌、乳酸菌、芽孢杆菌等微生物均可产酸，醋醅总酸含量的变化见图6。

由图6可知，两组醋醅的总酸含量均随着发酵的进行逐渐增大，其中沪酿1.01组总酸含量从起始的0.34 g/100 g上升至发酵7 d时的2.71 g/100 g，露底后总酸含量显著升高，而后缓慢增加至发酵18 d时的6.14 g/100 g，总酸含量不再升高，终止发酵；对比发现，DHC23组总酸含量较沪酿1.01组增速大，发酵至第17天时总酸含量为6.26 g/100 g，而后总酸含量有所下降，终止发酵。

不挥发酸是衡量食品酸味柔和性的关键指标，也是食醋品质优劣的重要指标。不挥发酸以乳酸菌代谢的乳酸为主，其含量变化见图7。

由图7可知，不挥发酸含量的变化与过杓上醅、露底阶段乳酸菌菌落总数变化趋势一致，DHC23和沪酿1.01两组醋醅均是先缓慢上升，再分别快速增大至发酵第7天时的3.55 g/100 g和3.31 g/100 g，达到峰值后缓慢降低，且前者不挥发酸含量更高。发酵第11 d时不挥发酸上升可能是因为露底阶段第一次倒醅，下醅醋液含有的菠萝有机酸随翻醅重新混合在醋醅中。

2.4 醋液有机酸分析

分别测定两组醋醅淋醋后醋液中的有机酸含量，并对比了菠萝汁中有机酸含量，结果见表1。

DHC23组醋液中乙酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸和焦谷氨酸含量均比沪酿1.01组含量高，且差异显著；苹果酸含量则刚好相反，虽然DHC23组草酸含量也较沪酿1.01组高，但差异不显著。DHC23组醋醅中醋酸菌和乳酸菌菌落总数较高，代谢活跃，可以解释其乙酸和乳酸含量高于沪酿1.01组，而其他有机酸涉及醋醅复杂的微生物群落动态变化及其代谢，有待于进一步探究；固态发酵食醋中苹果酸含量未见报道，因此实验组醋液中含有的苹果酸应为原料菠萝汁中的苹果酸，而苹果酸为三羧酸循环的中间代谢物，可能参与了醋醅微生物代谢，代谢旺盛的DHC23组微生物可能消耗了更多的苹果酸，导致其含量比沪酿1.01组低。

2.5 醋液挥发性风味成分分析

菠萝糯米果粮醋在醋酸发酵阶段，分别接种耐高温、耐乙醇、耐乙酸的醋酸菌DHC23和传统醋酸菌沪酿1.01，并同时接种乳酸菌DHR17，探究其对菠萝糯米醋挥发性成分的影响，见表2。

由表2可知，DHC23组醋液中共检测出47种挥发性成分，其中醇类9种、醛类3种、酮类3种、酸类8种、酯类20种、其他类4种，分别占总挥发性成分的16.70%、9.18%、4.53%、21.89%、40.15%、3.58%；沪酿1.01组醋液中共检测出46种挥发性成分，仅酯类比DHC23组少1种，上述6种成分分别占比17.63%、12.66%、3.81%、28.69%、31.48%、2.08%，因此，两组醋液挥发性成分种类差异不显著，醇类、酮类、其他类占比差异也不显著，但醛类、酸类和酯类占比差异显著（Plt;0.05）。

醋液中检测到的异丁醇、3-甲基丁醇、2，3-丁二醇、正己醇、苯甲醇、苯乙醇为镇江香醋常见的醇类物质[22]，其中苯乙醇、3-甲基丁醇、2，3-丁二醇3种醇类成分百分含量较高，DHC23组醋液苯乙醇占比较沪酿组高，且差异显著，而4-萜烯醇、α-松油醇、芳樟醇在镇江香醋未见报道，可能是原料菠萝汁的带入或作为原料代谢。两组醋液的醛类物质均为3种，其中DHC23组糠醛含量较沪酿1.01组低，且差异显著，可能是前者醋酸发酵温度高，微生物将部分糠醛代谢转化为其他物质。检测出的酮类成分2，3-丁二酮、3-羟基-2-丁酮、二氢-5-戊基-2（3H）-呋喃酮均为镇江香醋标志性成分，DHC23组醋液2，3-丁二酮、3-羟基-2-丁酮占比较沪酿组高，且差异显著。镇江香醋中乙酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、2-羟基-4-甲基戊酸乙酯、丁二酸二乙酯、十六酸乙酯和乳酸异戊酯等酯类物质在两组醋液中均被检测到，且占比均较高。DHC23组的酸类物质占比显著低于沪酿1.01组，而酯类物质则相反；其他类物质如2，3-二甲基吡嗪、2，3，5，6-四甲基吡嗪、4-甲基愈创木酚，DHC23组均显著高于沪酿1.01组，可能是前者醋醅温度较高促进了酯化反应、吡嗪类物质合成反应的进行。

3 结论

在醋酸发酵过杓阶段，乳酸菌和醋酸菌菌落总数均是先经过环境的适应后快速增大到峰值然后缓慢下降，这种下降趋势一直持续到露底阶段，直至发酵结束。过杓阶段上醅温度总体与菌落总数的变化趋势一致，但受翻醅的影响较大，呈现周期性的回落波动，露底阶段亦如此；由于过杓阶段分层翻醅自上而下进行，下醅主要进行厌氧发酵，其温度总体稳定。 醋醅总酸含量平稳增高，至不再升高时终止发酵，而不挥发酸则是先升高，在过杓阶段达到峰值，而后逐渐降低。醋醅中醋酸菌DHC23显示出更高的温度耐受性，在相同的发酵阶段其菌落总数也较沪酿1.01大，使醋酸发酵时间缩短1 d。对比分析了淋醋后醋液中8种有机酸的含量，DHC23组醋液中乙酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸、酒石酸和焦谷氨酸含量均比沪酿1.01组含量高，而苹果酸含量则刚好相反，菠萝汁作为酿造原料显著提高了醋液中苹果酸的含量。

以菠萝和糯米为原料，经过耐高温、耐乙醇、耐乙酸醋酸菌DHC23发酵，不仅缩短了醋酸发酵时间，而且代谢产生了4-萜烯醇、α-松油醇、芳樟醇等传统镇江香醋未检测到的醇类物质，进一步耦合了菠萝原料中醇类、酸类和酯类等丰富的混合果香气成分，从而形成了以乙酸、苯乙醇、糠醛、乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、乳酸异戊酯、丁二酸乙酯、乙酸苯乙酯等香气物质为主要成分、具有果香和谷物醋香气的菠萝糯米醋。

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