菊花脑PYL基因家族的全基因组鉴定及表达分析

摘" " 要：PYL（Pyrabactin resistance 1-like）蛋白作为脱落酸信号转导的核心组件，在植物生长发育和逆境胁迫响应中起到重要作用。为探究菊花脑PYL家族的功能，利用生物信息学方法鉴定菊花脑（Chrysanthemum nankingense）PYL基因家族成员，并利用RNA-Seq数据分析CnPYLs在不同组织中的表达情况。结果表明：CnPYL家族包括11个成员，分为3个亚家族，同一个亚家族的各成员蛋白结构域和基因结构高度保守，其中亚家族I基因含有2个内含子，其他2个亚家族基因没有内含子；CnPYL家族基因启动子区域顺式作用元件主要包括逆境胁迫响应元件、植物生长发育相关元件、光响应元件和激素响应元件。同时，RNA-Seq数据分析表明，PYL基因在菊花脑中的表达具有组织特异性，除CnPYL2基因在根中的表达量较低外，其他CnPYLs基因在菊花脑各组织中的表达都很高。这说明PYL作为ABA受体成员，参与了ABA调控的菊花脑各组织的生长发育过程。综上，本研究结果为深入研究CnPYLs基因的功能提供了基础信息。

关键词：PYL；基因家族；生物信息学；菊花脑；基因表达

中图分类号：S682.1+1" " " " "文献标识码：A" " " " DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2024.08.002

Genome-wide Identification and Expression Analysis of PYL Gene Family in Chrysanthemum nankingense

ZHENG Chongjiu1， SONG Ziwen2， YANG Junjun1， ZHANG Bing3， AI Penghui2

（1. Kaifeng Landscaping Center， Kaifeng， Henan" 475004， China; 2. Henan University， Kaifeng， Henan" 475004， China; 3. Puyang Academy of Agricultural and Forestry Sciences， Puyang， Henan" 457000， China）

Abstract： PYL （Pyrabactin resistance 1-like） protein plays an irreplaceable role， that plays an important role in plant growth， development and stress. In order to explore the function of PYL gene family in Chrysanthemum nankingense， this study identified PYL gene family members in Chrysanthemum nankingense using a bioinformatic methods， and the expression of CnPYLs in different tissues was analysed using RNA-Seq data. The results showed that the CnPYL gene family consists of 11 members， which could be divided into 3 subfamilies， and protein domains and gene structures were highly conserved of the same subfamily， the subfamily I gene contained two introns and the other two subfamily genes had no introns. Cis-acting elements analysis found that PYL family genes mainly contained elements related to stress， growth， light and hormone. The cis-acting elements in the promoter region of CnPYL family genes mainly included adversity stress-responsive elements， plant growth and development-related elements， light-responsive elements and hormone-responsive elements. RNA-Seq data analysis showed that the expression of PYL gene in Chrysanthemum nankingense was tissue-specific， exception of the CnPYL2 gene， which was expressed at a relatively low level in roots， indicating that these genes might play an essential role in the ABA-regulated growth and development of various tissues of the Chrysanthemum nankingense. The results of this study lay a theoretical foundation for further elucidating the function of" CnPYLs gene in Chrysanthemum nankingense.

Key words： PYL; gene family; bioinformatics; Chrysanthemum nankingense; gene expression

PYL作为脱落酸（ABA）的受体，能感知ABA信号，激活下游基因的表达，通过识别传递ABA信号，参与植物生长发育、生物和非生物胁迫应答等功能[1-5]。目前，研究者已在向日葵（Helianthus annuus L.）[6]、拟南芥（Arabidopsis thaliana）[7]、葡萄（Vitis vinifera）[8]、棉花（Gossypium hirsutum L.）[9]、玉米（Zea mays）[10]番茄（Solanum lycopersicum）[11]中分别鉴定出9、14、6、27、13、20个PYL基因家族成员以及表达分析，为进一步解析PYL基因的功能奠定了重要基础。

植物生长发育具有不同时空特异的复杂性，而ABA参与调控了植物的整个生长发育过程以及胁迫条件下的很多植物生理过程，是植物生长所必须的激素之一[12]。植物在不同发育时期及不同组织中感知并传递ABA信号，从而行使不同的调控功能，这可能需要不同的PYL受体，因此不同物种中均存在多个PYL同源基因，很多PYL基因参与了抗逆胁迫反应，这些同源PYL基因在植物体内的表达均具有组织特异性[13]。例如，枸杞中大多数LbPYL基因在根中的表达水平高于其他组织，而在花中的表达量普遍较低。LbPYL1和LbPYL2基因在叶片中的表达量最高，LbPYL12基因在果实中的表达量最高[14]。甘薯中PYL3基因在成熟叶片和茎中的表达量高，PYL5基因在根中的表达量高，PYL8基因在很多组织中的表达量都很低，其可能参与了胁迫反应，一些PYL在根中的表达量还受到不同发育时期的影响[15]；陆地棉中有40个PYL基因，它们有显著的时空特异性表达模式，PYL2A1基因主要在茎中表达，PYL2D1基因特异性在受精后20 d的胚珠中表达，PYL8D2基因在早期到晚期发育的胚珠中高表达，而与PYL8D2基因相似性最高的PYL8A2基因在早期到晚期发育的胚珠中低表达[16]。因此，了解PYL基因的时空表达定位可为解析基因功能提供重要的基础信息。

菊花（Chrysanthemum×morifolium Ramat.）是世界著名花卉之一，除了观赏用途外，还有药用价值和食用价值[17]。随着人口数量的增多，粮食作物和经济作物在良田种植方面形成了竞争，菊花的生产趋向于转入贫瘠、干旱和盐碱土壤中，胁迫严重影响菊花的品质和产量[18]。而菊花经过长期种间杂交和人工选育，遗传多样性变小，培育抗盐品种相对困难。菊花脑是菊花的原始种之一，在长期的遗传转化过程中，为适应自然环境，其保留了大量的抗逆相关基因，这是拓宽菊花栽培种抗逆的重要基因库，而且菊花脑也有了完备的基因组信息[19]。因此，研究菊花脑抗逆机制以及挖掘抗逆基因都会为栽培菊花的抗逆育种提供很好的理论和应用基础。本研究以菊花脑基因组数据为基础，利用生物信息学方法对菊花脑PYL基因家族进行成员鉴定，分析其保守基序、基因结构、启动子顺式作用元件和复制进化等，为进一步阐明菊花脑CnPYL基因的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菊花脑PYL家族成员的鉴定

本研究从菊花脑数据库（http：//www.amwayabrc.com/zh-cn/index.html）下载菊花脑全基因组数据，从Ensembl Plants数据库（https：//plants.ensembl.org/index.html）和拟南芥基因数据库（https：//www.arabidopsis.org）下载已鉴定出的水稻和拟南芥PYL基因文件和蛋白氨基酸序列，将拟南芥和水稻蛋白序列在菊花脑数据库中进行BlastP同源比对，使用HMMERv3.1b2对所得到的菊花脑PYL基因家族成员序列进行检测，将不包含PYL保守蛋白基序和蛋白功能域的序列、结构缺失序列删除。本研究利用得到的核酸序列在菊花脑全基因组数据库（http：//210.22.121.250：8880/asteraceae/download/download

Page）比对获得基因在染色体的位置。本研究使用ExPASy网站（https：//web.expasy.org/protparam/）预测菊花脑PYL基因家族成员蛋白理化特性，使用网站（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioin）预测CnPYL蛋白的亚细胞定位。

1.2 菊花脑PYL基因家族成员的染色体定位分析

本研究利用TBtools对菊花脑全基因组文件进行处理，获得菊花脑9条染色体长度，结合已得到的菊花脑PYL基因在染色体上的位置信息，使用TBtools完成菊花脑PYL基因染色体定位图的绘制，确定PYL基因在菊花脑中的具体位置。

1.3 菊花脑系统的进化树构建、moitf分析和多重序列比对

本研究利用从Ensembl plants数据库得到的拟南芥（A. thaliana）和水稻（O. sativa）的PYLs蛋白质序列，使用MEGA 11.0制作系统进化树。比对方法选用Clustal W，建立系统进化树，并通过iTOL v6（https：//itol.embl.de/）美化进化树。通过MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme），笔者对菊花脑CnPYL基因家族蛋白质的保守基序进行研究，确认数目为8个，使用这些MEME文档以及菊花脑基因序列在TBtools上绘制基因的结构以及蛋白质的保守基序图。

1.4 菊花脑PYL基因家族的共线性分析

本研究从菊花基因组网站（http：//www.amwayabrc.com）获取菊花脑全基因组序列文件，并利用TBtools进行菊花脑全基因组序列的自我比对，以此来研究CnPYL家族成员的复制行为。本研究将从Ensembl Plants数据库得到的水稻和拟南芥的全基因组序列文件与菊花脑全基因组序列作比对，获得PYL基因之间的共线性关系。

1.5 菊花脑PYL基因启动子区域的顺式作用元件分析

本研究在PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Plantcare/html）中提交所有的CnPYL启动子序列，分析启动子区域顺式作用元件，通过TBtools实现可视化。

1.6 基于RNA-seq的PYL基因表达谱分析

菊花脑的叶、茎、根、花蕾、管状花和舌状花的原始RNA-Seq数据从菊花基因组数据库（http：//www.amwayabrc.com）下载。然后，计算每个基因每千碱基转录本每百万个片段映射的片段数值（FPKM），并对每个CnPYL基因的FPKM值log2（倍数变化）处理，0替换成0.001，生成对应的转换值，使用转换值生成热图。可视化热图使用在线工具（https：//www.omicstudio.cn）上的OmicStudio工具绘制。

2 结果与分析

2.1 菊花脑PYL基因家族成员的鉴定及蛋白理化性质分析

由BlastP分析可知，在菊花脑中共得到11个PYL家族基因。根据基因在染色体上的位置，将11个PYLs基因分别命名，并预测11个CnPYL蛋白的物理化学性质，见表1。结果显示，CnPYL基因家族成员的氨基酸数目为151～217个（表1），蛋白质相对分子质量为16.77～24.17 kD，蛋白理论等电点（pI）范围为4.53～9.30。在该PYL基因家族中，11个CnPYL蛋白均为亲水蛋白。亚细胞定位预测显示，CnPYL蛋白质可定位于细胞质、叶绿体、细胞核（表1）。蛋白质不稳定指数低于40为稳定蛋白，在PYL家族成员中，除了CnPYL1、CnPYL2、CnPYL5、CnPYL8是稳定蛋白外，其余都是不稳定蛋白。

2.2 菊花脑PYL基因家族成员的染色体定位分析

如图1所示，11个CnPYLs基因不均匀地分布在5条染色体和1条tig00040149上。其中，CnPYL1基因在chr1上，CnPYL2、CnPYL3、CnPYL4、CnPYL5基因在chr5上，CnPYL6基因在chr7上，CnPYL7和CnPYL8基因在chr8上，CnPYL9和CnPYL10基因在chr9上，CnPYL11不在染色体上，而是在tig00040149上。

2.3 菊花脑PYL基因家族成员的系统进化分析

为进一步了解菊花脑PYL基因家族的进化关系，将菊花脑的11个PYLs蛋白序列与拟南芥和水稻的PYLs蛋白序列比对，构建进化树（图2）。结果表明，所有的PYL蛋白可分为3个亚族（图2）。CnPYL基因家族在进化关系上与拟南芥更接近，根据拟南芥PYL基因和菊花脑PYL基因的进化关系，可将CnPYL家族成员分为3个亚家族。在GroupⅠ中，6个CnPYL、7个OsPYL、4个AtPYL聚为一类；GoupⅡ中，3个OsPYL、3个CnPYL、6个AtPYL聚为一类；GroupIII中，3个OsPYL、2个CnPYL、3个AtPYL、1个AtPYR聚为一类。CnPYL1在进化关系上与AtPYL4最接近，推测二者在某种功能上具有相似性。

2.4 菊花脑PYL蛋白保守基序及基因家族成员的结构分析

对蛋白保守基序分析发现，同一亚家族的PYL基因具有相似的保守基序，基因结构也相似，而不同亚家族间则有差异。一些基因具有特殊的保守基序，如Motif5只出现在亚家族Ⅰ的CnPYL11和CnPYL6中（图3），Motif6只存在于亚家族Ⅱ、Ⅲ中，而Motif1在11个CnPYL基因中都出现。这说明Motif1在PYL家族的进化过程中保守性较高。大量研究表明，在同一个亚家族里，具有相似进化关系的基因，其外显子-内含子结构相似[20]，这与笔者在菊花脑中的发现一样，同一个亚家族成员之间的外显子-内含子结构相差不大（图3）。菊花脑PYLs基因结构并不复杂，亚家族Ⅱ和Ⅲ中的基因不含有内含子且只有1个外显子，亚家族Ⅰ中的基因内含子和外显子数目多余其他亚家族基因，基因结构也相对比较复杂。

2.5 菊花脑CnPYL基因家族的共线性分析

对共线性和基因复制事件分析可知，该基因未发生串联重复事件，但本研究发现4个基因参与了2个片段的重复事件（CnPYL7和CnPYL2、CnPYL4和CnPYL9）（图4）。为深入研究PYL基因的进化关系，本研究对拟南芥、水稻与菊花脑之间进行共线性分析。如图5所示，菊花脑和拟南芥具有9对共线性关系，菊花脑和水稻具有6对共线性关系。菊花脑与其他植物PYL基因的比较分析为建立种间亲缘关系提供了参考，也为研究菊花脑PYL基因的功能提供了重要依据。

2.6 菊花脑PYL家族基因启动子区域的顺式作用元件分析

对CnPYLs基因启动子区域顺式元件分析可知，39种顺式作用元件高频出现在CnPYLs启动子中（图6）。CnPYLs启动子中主要有激素响应元件、胁迫响应元件、光响应元件和植物发育元件。在菊花脑中，每个PYL基因都有光响应元件和生长发育相关元件。其中，在数量上，光响应元件最多，胁迫响应元件次之（图7）。ABRE是参与脱落酸响应的顺式作用元件，CnPYLs启动子区域有大量的ABRE位点，这与PYL作为脱落酸受体的功能一致。生长素反应元件（ARE）、赤霉素反应元件（P-box）、水杨酸响应元件（TCA-element）在菊花脑PYL基因的启动子中也有出现。结果表明，PYLs基因广泛参与菊花脑的激素代谢过程和信号转导网络，调控菊花脑生长发育过程中很多植物生理过程。此外，在CnPYLs中还鉴定出胁迫相关元件，包括低温响应（LTR）元件、参与干旱诱导性（MBS）的MYB结合位点、防御和胁迫响应性（富含TC的重复序列）。这说明PYL家族基因在响应生物和非生物胁迫中也发挥着重要作用。

2.7 菊花脑PYL基因家族的组织表达分析

基于RNA-Seq数据，使用FPKM值计算CnPYLs基因在菊花脑不同组织中的表达趋势，生成CnPYLs基因表达热图（图8）。结果显示，在根、茎、叶中，所有PYLs基因的表达总量都要超过其他组织，茎中所有PYLs基因的表达总量最多，其中CnPYL7基因在茎中的表达量接近全部茎中PYLs基因表达总量的40%。CnPYL2在根中的表达量极低（FPKM=0），但在其他组织如叶、花、茎中都存在表达（FPKMgt;0）。CnPYL4基因在舌状花和茎中的表达均低于其他组织。CnPYL7、CnPYL3在所有组织中都有着很高的表达量（FPKMgt;20）。在叶、根和花这3个组织中，叶中高表达基因有CnPYL1、CnPYL3、CnPYL5、CnPYL7（FPKMgt;32），根中高表达基因有CnPYL3、CnPYL5、CnPYL7、CnPYL8（FPKMgt;20），花中高表达基因有CnPYL3和CnPYL7（FPKMgt;20）。PYL蛋白作为ABA受体，在植物体内过量表达能提高植物对ABA的敏感性，使ABA加强对种子萌发和植物生长的抑制效应。菊花脑中CnPYL基因在各个组织中都有表达（FPKMgt;0），多数组织也有高表达基因（FPKMgt;20），这也在一定程度上证实了PYLs基因功能的多样性。

3 讨论与结论

3.1 讨论

植物激素脱落酸对调节植物发育和响应非生物和生物胁迫反应中具有十分关键的作用[21-22]。PYL蛋白是ABA的直接受体蛋白，主要参与调控ABA的信号传导。目前已在棉花（27个GhPYLs基因）[9]、蒺藜苜蓿（14个MtrPYLs基因）[23]、水稻（12个OsPYLs基因）[24]等多个物种中鉴定出该基因家族。本研究在菊花脑中鉴定出11个CnPYLs基因，菊花脑中PYL基因数量与蒺藜苜蓿、水稻、棉花等物种相比较少。蛋白理化性质分析表明，菊花脑PYL基因家族成员的平均分子质量为20.95 kD，平均pI为6.57（表1）。CnPYL有2个蛋白质为碱性，其余为酸性蛋白；该基因家族中，所有蛋白均为亲水性，这些性质和其他物种中报道一致[23-25]。在拟南芥、水稻、菊花脑PYL家族基因的系统进化树分析中，笔者发现菊花脑CnPYL家族的11个基因可以分为3个亚家族。其中，CnPYL1与AtPYL4的进化距离最近，二者功能可能有相似之处，CnPYL1可能也参与了ABA和干旱引起的气孔运动和根系伸长等过程[25]。此外，motif1在所有亚家族中都存在，这表明它在菊花脑PYL基因家族的进化过程中是较为保守的。

通过对菊花脑PYL基因组中基因重复分析，我们可以更清晰地认识该基因家族的扩展与作用。本研究发现，菊花脑PYL基因家族中只有2对基因存在共线性，分别是CnPYL7和CnPYL2、CnPYL4和CnPYL9，基因复制现象不显著，只存在片段重复。通过与拟南芥和水稻共线性分析，笔者发现菊花脑PYL基因和拟南芥之间的关联性较高，推测菊花脑PYL基因在进化关系上和双子叶植物PYL基因更为接近。这些结果与草莓PYL基因家族的研究结果较一致[26]。在植物进化过程中，有着类似内含子-外显子结构和保守基序的基因通常功能类似[20]。进一步对基因结构分析，笔者发现亚家族Ⅰ中除了CnPYL8以外，其余基因均有2个内含子，亚家族Ⅱ、Ⅲ中的基因没有内含子。在11个CnPYLs基因中，基因内含子数量均小于4个，并且亚家族Ⅱ、Ⅲ中不含有内含子。这表明有内含子丢失的存在，PYL基因内含子丢失的现象在其他物种中也普遍存在[11，27]。

启动子顺式作用元件分析和转录因子预测是预测基因潜在功能的有效手段[28]。与其他物种一样，CnPYLs基因启动子中主要有以下4种顺式作用元件：逆境胁迫响应元件、生长发育相关元件、激素响应元件和光响应元件[26-27]。

PYL基因在植物的各个组织和不同的生长发育阶段中功能具有多样性[26]。因此，研究CnPYLs基因在菊花脑不同组织中的表达谱可为了解它们多样性的功能提供依据。大量研究发现，PYL基因在植物的根、种子、叶、花等多种组织中均有表达[29-31]。小麦中TaPYL33、TaPYL35和TaPYL37在籽粒中的表达量较高，TaPYL30、TaPYL32和TaPYL34在根系中的表达水平最高[30]。水稻中大多数PYLs在组织中的均能检测到，但表达量具有差异性。OsPYL2和OsPYL9在所有组织中的表达量都很高，OsPYL7、OsPYL8主要在胚中高表达，只有OsPYL1在根中高表达[31]。本研究中，PYL基因家族具有组织特异性表达模式。CnPYL5在根中的表达量较高，CnPYL1在叶组织中的表达量最高。据报道，在ABA存在下，AtPYL1的过量表达对拟南芥种子萌发有抑制作用[32]。菊花脑中对应的同源基因CnPYL7在各组织中均为高表达，其可能参与了种子休眠过程。

3.2 结论

本研究利用生物信息学方法鉴定和分析了菊花脑的11个PYL家族基因。由蛋白理化性质分析可知，CnPYL蛋白均为亲水蛋白。通过系统进化分析，本研究将CnPYL分为3个亚家族，即亚家族Ⅰ、亚家族Ⅱ和亚家族Ⅲ。亚家族内的成员在结构特点和保守基序上较为相似。CnPYLs基因启动子区域存在多种与胁迫相应和激素响应密切相关的顺式作用元件，同时CnPYLs基因的表达具有组织特异性。这些结果为探究菊花脑PYL基因家族的功能提供了参考。

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