添加菜籽饼或菜籽油对植烟土壤差异代谢物的影响

摘要：为明确施用菜籽饼或菜籽油对植烟土壤代谢物的影响，采用拟靶向代谢组学技术，分析土壤差异代谢物的变化特征。结果表明：与未施用菜籽饼或菜籽油的对照土壤比较，施用菜籽饼筛选出43种土壤差异代谢物，施用菜籽油共筛选出9种。施用菜籽饼培养的土壤，土壤差异代谢物主要为谷氨酰胺、脯氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、亮氨酸、L-异亮氨酸、焦谷氨酸和赖氨酸8种氨基酸，上调表达14.72～207.94倍；施用菜籽油培养的土壤，土壤差异代谢物主要为油酸、油酸异构体、十六烯酸异构体、二十酸和海松酸5种有机酸，上调表达1.73～225.97倍，另有乳糖和松二糖2种糖类分别上调表达3.12和16.91倍。综合可知，施用菜籽饼增加土壤中氨基酸等高氮代谢物积累，施用菜籽油提高土壤中有机酸、糖等高碳代谢物积累。

关键词：植烟土壤；土壤培养；菜籽饼；菜籽油；土壤代谢物

中图分类号：S154.2 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2024）09-0063-05

Effects of Rapeseed Meal or Oil on Differential Metabolites in Tobacco-Planting Soil

LONG Yong1，LIN Ye-chun2，CAI Kai2，AI Yong-feng3，LI Hong-xun2，CHEN Dai-rong3

（1. Songtao Branch of Tongren Tobacco Company， Songtao 554100， PRC; 2. Guizhou Academy of Tobacco Science， Guiyang 550081， PRC; 3. Tongren Tobacco Company， Guizhou Provincial Tobacco Company， Tongren 554300， PRC）

Abstract： Pseudo-targeted metabolomics was employed to identify the differential metabolites in soil， on the basis of which the effects of the application of rapeseed meal or oil on metabolites in tobacco-planting soil were examined. Compared with the soil without application of rapeseed meal or oil， the soil with application of rapeseed meal and oil showed 43 and 9 differential metabolites， respectively. The differential metabolites in the soil with the application of rapeseed meal were mainly glutamine， proline， alanine， γ-aminobutyric acid， leucine， L-isoleucine， pyroglutamic acid， and lysine， which were up-regulated by 14.72 to 207.94 folds. The differential metabolites in soil with the application of rapeseed oil mainly included oleic acid， oleic acid isomers， hexadecenoic acid isomers， eicosoic acid， and pimaric acid， which were up-regulated by 1.73 to 225.97 folds. In addition， lactose and turanose were up-regulated by 3.12 folds and 16.91 folds， respectively， in the soil treated with rapeseed oil. In conclusion， the application of rapeseed meal promoted the accumulation of high nitrogen-containing metabolites such as amino acids in the soil， while the application of rapeseed oil increased the accumulation of high carbon-containing metabolites such as organic acids and sugars in the soil.

Key words： tobacco-planting soil; soil culture; rapeseed meal; rapeseed oil; soil metabolite

菜籽饼又称油枯，是油菜籽榨油后余下的副产物，含有丰富的蛋白质等含氮有机营养物质，是优质的有机肥源，能够改善土壤条件[1]。菜籽饼肥在腐解过程中，铵态氮含量先快速升高后大幅回落，硝态氮含量则持续升高，但总氮含量仍表现为增加趋势；菜籽饼含有大量有机质，能够疏松土壤结构，有效降低土壤容重[2]。施用菜籽饼肥，可提高烟叶产量和产值，改善初烤烟叶质量。施用菜籽饼可提高初烤烟叶单位面积产量12.4%，产值增加12.8%[3]；施用菜籽饼肥促进连作障碍烟田烟株的生长发育，可提高初烤烟叶产量195 kg/hm2[4]。合理施用菜籽饼肥，能改善初烤烟叶油分等外观质量，提升烟叶糖碱比等化学协调性，增加烟叶香气量[5-6]。针对肥力水平较高的土壤，增施菜籽饼肥提高了烟叶产量，但烘烤难度增大，降低了上等烟比例[7]。虽然菜籽饼作为有机肥在烤烟生产中应用较普遍，但随着植烟土壤肥力水平的不断提升，应避免单独或连续施用菜籽饼肥[8]。

近年来，菜籽压榨和生产菜籽饼肥过程中的下脚菜籽油也被用于烤烟生产。在烤烟团棵期，用菜籽油对烟株灌根，初烤烟叶产量提高4.67%～9.39%，产值增加6.26%～11.84%；中上部烟叶油分由“稍有”提升至“有”或“多”，叶片结构更加疏松；降低中上部烟叶烟碱含量、提高总糖含量，烟叶化学成分更加协调；香气质更优、香气量更足，杂气减弱、刺激性变小，余味更加舒适，改善了烟叶感官品质[9]。

菜籽饼主要含有蛋白质、多糖、矿物质等营养物质，粗蛋白含量35%～40%[10]；菜籽油主要含有油酸、亚油酸、亚麻酸、饱和脂肪酸、甾醇、多酚等营养物质[11]。菜籽饼和菜籽油的营养物质组成存在较大差异，目前，关于二者施用于土壤，影响土壤代谢物组成的相关报道仍较少。因此，笔者通过土壤培养试验，旨在探明土壤代谢物对菜籽饼和菜籽油的不同响应，为烤烟品质提升提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 供试土壤

2022年9月，采集铜仁市松桃县长坪乡烤烟种植地块0～20 cm耕层土壤，避光处自然风干，剔除石块、植物根系等杂质后，过2 mm筛备用。取样地块0～20 cm土壤的田间最大持水量为25%，土壤有机质含量33.84 g/kg，碱解氮、有效磷和速效钾分别为158.88、53.64和619.79 mg/kg，土壤pH值6.34。

1.2 供试菜籽油和菜籽饼

选取本地当年油菜籽（品种为油研2020），采用物理压榨工艺，得到菜籽油以及相应的菜籽饼用于试验。

1.3 土壤培养

1.3.1 土壤处理 参考铜仁松桃烤烟生产中菜籽油和菜籽饼施用水平（5 L/667m2和15 kg/667m2），开展土壤培养试验，过筛土壤设置空白（CK）、菜籽饼（CB）和菜籽油（CY）3种处理，每个处理重复4次。每个重复称取过筛土壤1 000 g（含水量12.6%），其中，CB处理加入15 g菜籽饼并混匀，CY处理加入5 mL菜籽油并混匀。

1.3.2 培养环境温湿度 培养箱温度设置为25℃（当地5月平均气温19～27℃），湿度为自然环境湿度，培养全过程处于黑暗环境。首次浇水量120 mL/盆（2022年10月29日）。调节土壤含水量至80%田间持水量（初始水分），每3 d采用称重法计算补水量，调节土壤水分至初始状态，每盆补水量（mL）=80%田间持水量（g）+土壤干重（g）-每盆湿土重量（g）。

1.3.3 培养土壤样品采集 在培养30 d时，每盆取3个点，钻取0～5 cm范围的土壤，混合均匀装入5 mL离心管中，立即置于液氮中，速冻后存入-80℃冰箱备用。

1.4 土壤代谢物分析

参照CAI等[12]建立的微波辅助衍生化–气相色谱-质谱（GC–MS）方法，开展培养土壤的代谢物分析。

1.4.1 土壤代谢物提取 培养土壤样品经冻干处理48 h。取0.5 g冻干土壤置于10 mL玻璃锥形管中，加入6 μL 2–甲氧基酚–d3、L–正缬氨酸、己二酸、核糖醇、棕榈酸–d31和苯基–β–D–吡喃葡萄糖苷水合物混合内标（IS）溶液（0.250、0.272、0.528、0.210、0.260和0.520 mg/mL，50%甲醇为溶剂），加入1.5 mL预冷（4℃）甲醇–水（v∶v = 3∶2）萃取溶剂。在4℃涡旋（2 500 r/min）5 min后提取土壤样品。然后，将样品离心5 min（3 000 r/min，4℃）并过滤上清液。提取过程分别用0.8 mL甲醇–水（v∶v = 3∶2）和0.8 mL水重复2次，将组合提取液置于约4℃的CentriVap离心浓缩仪（美国）中冷冻干燥18 h。

1.4.2 微波辅助衍生化（肟化与硅烷化） 冻干提取物用300 μL甲醇重新溶解，然后离心以除去颗粒不溶性盐。将上清转移2 mL螺旋颈最大回收瓶（Waters，美国），然后在平缓的氮气流下干燥。为完全去除残留水分，加入300 μL二氯甲烷干燥。衍生化反应在可用的微波炉（1 000 w，Panasonic NN–GN68KS）上进行。加入17 μL MEOX （25 mg/mL在吡啶中溶液中），在800 W能量下进行3+2 min的微波反应。然后，加入103 μL BSTFA （1%TMCS），进行3+3+3 min的微波反应。冷却后，加入5 μL正十二烷吡啶代物（1.00 mg/mL），所得溶液离心5 min（3 000

r/min）。将上清液转移到150 μL微量进样瓶中，取1 μL进样量进行GC–MS分析。分别采用内标物和仪器校正内标物进行相对定量计算和数据归一化。

1.4.3 GC–MS拟靶向代谢组学 安捷伦7890A–

5975C气质联用仪配备CTC PAL自动进取器，开展GC–MS分析（美国）。进样口保持在280℃，采用分流模式，分流比为8∶1。采用超纯氦作为载气，流速恒定为1.0 mL/min。采用HP–5ms色谱柱（60 m×0.25 mm内径×0.25 μm膜厚）进行分离。柱温箱温度如下：6℃持续2 min，以5℃/min升高至230℃，保持5 min，然后以8℃/min升高至290℃，保持25.5 min。将传输线温度和溶剂延迟分别设置为280℃和11.9 min。离子源和四极杆的温度分别保持在230和150℃。所有质谱均在70 eV的电子碰撞（EI）模式下获得。全扫描质谱数据采集，扫描范围为45～600 m/z。利用正构烷烃（C6–C40）的保留时间和AMDIS软件（自动质谱反卷积和识别系统）计算保留指数（RI）。手动检查并接受RI误差百分比阈值（≤1.0%）。

1.5 数据分析

采用Simca软件13.0进行PCA分析。采用Meta-boanalyst 5.0（http：//www.metaboanalyst.ca）进行偏最小二乘判别分析（OPLS–DA），并绘制代谢物火山图；结合VIP值（Variable important in projection，＞1.2）和显著性差异（P＜0.05），筛选土壤差异代谢物。

2 结果与分析

2.1 土壤代谢物主成分分析

采用多变量数据分析方法，研究添加菜籽油或菜籽饼对植烟土壤代谢物的影响，以区分不同模式下土壤代谢物变化，使用主成分分析方法（PCA），从总体上反映样本间差异及代谢物表达模式差异。由图1可知，CK、CY和CB处理组间差异明显，样本间坐标点较为聚集，易于区分，所有坐标点均位于置信椭圆内，表明各样本均处于95%置信度下，且组内样本相似性较高，数据处理可信度高。

2.2 土壤组间差异代谢物筛选

CB处理的培养土壤中（图2A），共鉴定出43种具有显著性差异（P＜0.05）的代谢物。与CK比较，CB处理中表达差异上调的代谢物有43种，没有下调表达的代谢物。CY处理的培养土壤中（图2B），共鉴定出9种具有显著性差异（P＜0.05）的代谢物。与对照比较，CY处理中表达差异上调的代谢物有8种，下调表达的代谢物1种。

分析了与对照相比CB或CY处理差异表达倍数排列前15的土壤代谢物（表1）。CB处理的差异代谢物主要为有机酸，且以氨基酸等土壤高氮代谢物为主；其中，氨基酸为谷氨酰胺、脯氨酸、丙氨酸、γ–氨基丁酸、亮氨酸、L–异亮氨酸、焦谷氨酸和赖氨酸等8种，与对照相比上调表达倍数14.72～207.94倍；其他有机酸主要为2–氧代戊二酸、对苯二甲酸、亚油酸/亚麻酸和肌糖磷酸等4种，上调表达倍数12.47～52.71倍。CY处理主要影响土壤高碳代谢物；其中，油酸、油酸异构体、十六烯酸异构体、二十酸和海松酸等5种有机酸与对照相比上调表达1.73～225.97倍，葡萄糖酸下调表达4.17倍；另外，松二糖和乳糖等糖类以及甘露糖醇显著上调表达。

3 讨论与结论

植烟土壤施用菜籽油或菜籽饼能够调控土壤代谢物，在施用菜籽油处理中筛选出9种土壤差异代谢物，施用菜籽饼处理中筛选出43种土壤差异代谢物。添加菜籽油处理，油酸、油酸异构体、十六烯酸异构体、二十酸和海松酸5种有机酸上调表达1.73～225.97倍，乳糖和松二糖2种糖类分别上调表达3.12和16.91倍；添加菜籽饼处理，谷氨酰胺、脯氨酸、丙氨酸、γ–氨基丁酸、亮氨酸、L–异亮氨酸、焦谷氨酸和赖氨酸8种，上调表达倍数14.72～207.94倍。菜籽饼的蛋白质等有机氮含量丰富[10]，而菜籽油中脂肪酸最为丰富[11]。据此推断，施用菜籽饼和菜籽油的土壤代谢物差异，可能与菜籽饼和菜籽油自身的主要物质组成差异有关。在常规种植和有机种植的玉米根际土壤中发现类似的现象，秸秆等有机碳投入为主的有机种植模式促进土壤有机酸及衍生代谢产物积累，而降低了土壤氨基酸及其前体代谢产物含量[13]。

在有机质含量较低（17.2 g/kg）的土壤中，施用菜籽饼肥能够显著促进土壤净矿化速率，施用后7 d土壤的铵态氮浓度可提高3.3～3.7倍[14]，并显著增加N2O的排放通量[15]，土壤中无机氮的增加与施用菜籽饼提高有机氮的积累量密不可分。对于土壤有机质含量较高（＞30 g/kg）的土壤，在施用菜籽饼有机肥的情况下，应同时降低化肥氮的投入量，才能兼顾烤烟生长和品质形成[16]。根据调查分析，植烟土壤肥力整体处于较高水平，尤其是碱解氮含量较高[17-19]。施用菜籽饼显著上调表达的土壤代谢物以氨基酸等含氮化合物为主，施用菜籽油显著上调表达的土壤代谢物以有机酸、糖类等含碳化合物为主，可能与菜籽饼和菜籽油对土壤微生物的不同调控效应有关[13]。在土壤肥力偏高、烟株发育偏旺、烟叶碱高糖低化学成分不协调等特殊现象的区域，通过减少土壤含氮化合物、增加土壤含碳化合物、提高土壤碳氮比，在一定程度上有利于改善烟叶内在品质、彰显烟叶风格特色。

施用菜籽饼显著提高了8种土壤氨基酸的上调表达倍数，而施用菜籽油显著提高了5种不含氮土壤有机酸和2种糖的上调表达倍数，土壤投入不同类型的有机物料会明显调节土壤代谢物组成。此外，有机物料投入对植烟土壤代谢物动态变化的影响、与土壤微生物群落结构特征与功能的关系，以及对烟叶产量和品质的作用等还需深入研究。

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（责任编辑：肖彦资）