一株具有杀松材线虫活性的马尾松内生菌分离及鉴定

摘要：为获得具有杀松材线虫活性的菌株，在湖南省浏阳市采集了健康马尾松、感染松材线虫病但尚未死亡的马尾松以及感染松材线虫病致死的马尾松材料，从中分离得到了27株内生细菌进行杀线活性的测定，并对高效拮抗菌株进行了鉴定。结果表明：从感染但尚未死亡的松树分离得到的细菌H-4都具有较高的杀线活性；在发酵液处理48 h后，菌株H-4的杀松材线虫活性最高，松材线虫校正死亡率和消解率分别达到97.1%和89.2%。综合考虑菌株H-4的形态学特征、生理生化测定结果以及16S rRNA系统发育树分析结果，确定菌株H-4为暹罗芽孢杆菌。

关键词：松材线虫；内生细菌；暹罗芽孢杆菌

中图分类号：S763 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2024）09-0073-05

Isolation and Identification of an Endophyte with Killing Effect on Pine Wood Nematodes from Pinus massoniana

HUANG Wen-jing1，LI Zhen1，XIA Yong-gang2，TAN Ze-bao1，XIAO Qin1，ZHU Huan-wu1，LUO Kun1

（1. College of Plant Protection， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC; 2. Hunan Academy of Forestry，

Changsha 410018， PRC）

Abstract： To obtain the strains capable of killing pine wood nematodes， we collected the healthy plants， the plants infected with pine wood nematodes but still alive， and the plants infected with pine wood nematodes and dead of Pinus massoniana from Liuyang City， Hunan Province. A total of 27 strains of endophytic bacteria were isolated and subjected to assessment of their nematocidal effects. Furthermore， the efficient antagonistic strains were identified. The results showed that strain H-4 isolated from the infected but still alive plants exhibited a high nematocidal activity. The treatment with the fermentation broth of strain H-4 for 48 h achieved the highest killing effect on pine wood nematodes， with the corrected mortality and clearance rates of pine wood nematodes reaching 97.1% and 89.2%， respectively. Strain H-4 was identified as Bacillus siamensis according to the morphological， physiological， and biochemical characteristics and the phylogenetic tree built based on the 16S rRNA sequence.

Key words： pine wood nematode; endophytic bacteria; Bacillus siamensis

松材线虫病，又称松树萎蔫病（Pine wilt disease，

PWD），是由松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）引起的具有毁灭性的的森林检疫性病害[1]。1982年，我国在江苏省南京市中山陵的黑松上首次发现松材线虫病[2]。松材线虫病传染性强、危害重[3]，据2022年的数据统计，松材线虫病覆盖19个省，发生面积达151.15万hm2[4-5]。松材线虫的防治包括物理防治、化学防治和生物防治。物理防治对控制技术要求高，使用范围相对较窄[6]；化学防治容易造成有害物质残留，且易导致植物产生抗性。因此，松材线虫的生物防治备受关注[7-8]。

植物内生菌和宿主植物联系紧密[9]。研究发现，植物内生菌具有杀线虫、抗病菌、抗氧化和分解糖类的作用[8，10]。例如：从松树内提取的内生真菌Esteya vermicola具有很强的杀线虫活性[11]，说明部分松树的内生菌对松材线虫病存在抗性。松树内生菌在松材线虫病的抑制防控方面具有巨大的潜力[12]，有望为松材线虫病的生物防治提供新的方法[5，13]。而且，相较化学防治而言，利用内生菌进行防治更符合现代农业防治的要求，因而近年来已成为生防菌剂开发的热点[14]。该研究在湖南省浏阳市采集了健康马尾松、感染松材线虫病但尚未死亡的马尾松以及感染松材线虫病致死的马尾松材料，对其内生菌进行分离鉴定，探究从不同材料提取的内生菌对松材线虫的杀线虫活性，以期为松材线虫病的生物防治提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在湖南省浏阳市葛家镇的松材线虫感染区采集健康马尾松、感染松材线虫病但尚未死亡的马尾松以及感染松材线虫病致死的马尾松作为试验材料；供试松材线虫由中国农业科学院蔬菜花卉研究所的茆振川课题组提供；培养基包括牛肉膏蛋白胨固体培养基（NA）、牛肉膏蛋白胨液体培养基（NB）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）和LB固体培养基。

1.2 研究方法

1.2.1 内生菌株的分离纯化 采用组织培养法对马尾松内生菌株进行分离纯化。去除采集的马尾松树干的外表层，每种材料取2 cm×2 cm的木质组织薄片5片，75%酒精浸泡1 min，6%次氯酸钾浸泡1 min，

无菌水冲洗3次，进行表面消毒。将消毒后的材料剪成2 mm×2 mm的小木块，每5块为1组，均匀放置于PDA和LB培养基中，每种样品接种3个平板。将平板置于28℃的恒温培养箱中，黑暗条件下培养，当木块周围长出菌落时，用接种环挑取少量菌落在新的PDA和LB培养基平板上划线培养，多次重复此操作，直至单菌落出现。

1.2.2 内生菌株培养液的制备 将纯化好的内生菌株分别接种至50 mL的NB培养基中，在28℃、160 r/min条件下培养3 d，得到菌株发酵液。将菌株发酵液在4℃、8 000 r/min条件下离心10 min，将离心后的上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，得到菌株发酵滤液[15-16]。

1.2.3 松材线虫悬浮液的制备 在超净工作台中，将灰葡萄孢菌饼倒置接种在PDA培养基平板中，在28℃培养箱中倒置培养7 d。当菌丝长满平板时，再接种松材线虫[17]。灰葡萄孢菌丝被松材线虫完全取食后，用无菌水清洗平板，以收集平板中的松材线虫，混合后配制成浓度为5 000条/mL的线虫悬液[15，18]。

1.2.4 松材线虫拮抗细菌的筛选 分别取200 μL NB培养基（CK）、内生菌发酵液加至细胞培养板中，然后各加入200 μL线虫悬浮液（约1 000条线虫），摇晃均匀，每个处理重复3次[19]。在室温下避光静置48 h后分别吸取50 μL混合溶液（约125条线虫）在显微镜下观察松材线虫存活情况并计数[20]，计算校正死亡率和消解率[15，21-22]。利用相同方法对筛选出的高效拮抗菌株的发酵液、发酵滤液进行试验，分别处理24、48 h后，计算校正死亡率和消解率。

1.2.5 拮抗细菌的鉴定 对筛选出的拮抗细菌进行菌株大小、边缘、形状和颜色等表面特征的观察，并对其进行革兰氏染色，测定其生理生化指标[23-24]。参照贺丽娜等[23]的方法，以细菌通用引物序列进行PCR扩增。取部分PCR产物检测有无条带，出现目的条带后委托北京擎科生物科技股份有限公司进行测序；获得测序序列后，使用MEGA 5.0软件构建系统发育树[22]。

2 结果与分析

2.1 内生菌的分离纯化及其杀线虫活性测定

采用组织分离法从健康、感染松材线虫病但尚未死亡和感染松材线虫病致死等3种马尾松茎杆材料内分别分离得到5、9、13株细菌。对分离得到的27株细菌的发酵液进行初步的杀线活性测定，发现从感染但尚未死亡的马尾松分离得到的细菌H-4的杀线活性最高（表1）。选取杀线能力最强的细菌H-4开展后续试验，对H-4的发酵液、发酵滤液进行杀线活性测定。由表2可知，细菌H-4发酵液的校正死亡率和消解率均高于对应的发酵滤液。发酵液静置处理48 h后，松材线虫的校正死亡率和消解率分别达到97.1%和89.2%。菌株H-4发酵液处理48 h后，可以发现松材线虫虫体形态发生明显变化，体壁被溶解，显微镜视野已观察不到完整的线虫虫体（图1）。

2.2 细菌H-4的鉴定

2.2.1 形态学特征与生理生化测定 蘸取H-4菌液在LB固体平板上划线，在细菌恒温培养箱培养24 h后，观察其菌落形态（图2），发现H-4菌落表面光滑、呈圆形、乳白色、有黏性且不透明。进行生理生化测定发现，H-4的V-P测定、明胶液化、硝酸盐还原、淀粉水解和纤维素酶试验呈阳性，甲基红、硫化氢、溶磷和蛋白酶试验呈阴性。

2.2.2 细菌H-4 16S rRNA测序分析 菌株H-4的序列总长为1 880 bp，PCR产物电泳检测结果如图3所示。根据测序结果构建系统发育树，由图4可知，菌株H-4与芽孢杆菌属（Bacillus）关系较近密切，并且与暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）的相似性最高；再综合考虑菌株H-4的形态学特征和生理生化测定结果，确定菌株H-4为暹罗芽孢杆菌。

3 讨论与结论

松材线虫病不仅严重威胁松林生态系统，而且会造成巨大的经济损失和不可估量的生态损失[25-28]。松材线虫病会受到环境条件与人类活动等各种因素的影响[29]，松材线虫可以通过松墨天牛进行远距离传播，生存定殖造成寄主植物的枯萎死亡[30]。松材线虫病严重影响了林业发展，至今仍难以对其进行全面而有效的控制[31-32]。研究发现，一些真菌、细菌对松材线虫有抑杀性，能有效防治松材线虫病[33-34]，

而且，生物防治是目前较为环保且有效的一种防治手段[35-36]。

Shanmugam等[37]分离出一株具有杀松材线虫活性的内生细菌Raoultella ornithinolytica MG，并发现该菌株存在一些可能与杀线虫活性相关的基因。Marques-Pereira等[38]发现，某些沙雷氏菌的发酵上清液和特定的氨基脂质对松材线虫有较高的杀线虫活性。李恩杰等[39]筛选到一株对松材线虫有较高杀灭活性的苏云金芽孢杆菌，且该菌株的发酵液具有较好的热稳定性。此外，还有研究发现某些贝莱斯芽孢杆菌[40]、放线菌[41]、真菌[42]也对松材线虫具有较高的杀灭活性。

该研究从3种松树材料中分离纯化得到27株细菌，发现从感染但尚未死亡的松树分离得到的细菌H-4具有较高的杀线虫活性。菌株H-4发酵液处理48 h时杀线活性最高，通过显微镜进行观察，可以发现部分线虫发生了溶解，其内含体流出，推测菌株H-4发酵液中的某种物质可以破坏松材线虫的体壁。发酵液中的次生代谢物质复杂，后续研究中考虑对其进行分离纯化，探究发酵液对线虫的抗性机制。

利用松树内生菌对松材线虫病进行预防和控制，可以为松材线虫病的防治提供新的微生物资源[43]，也有利于扩大生物防治技术的使用面。鉴于菌株H-4是从感染但尚未死亡的松树中分离出来的，推测提高该细菌在松树内的丰度可以提高松树对松材线虫病的抗性，或者使感病松树恢复健康状态。该研究采集的松树材料来自湖南地区，分离得到的细菌H-4可能主要针对湖南地区流行的松材线虫病，其对其他地区的松材线虫病的抑制情况仍有待探究。

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（责任编辑：王婷）