不同贮藏条件对秤锤树种子生理生化及活力的影响

摘 要：【目的】研究不同贮藏温度和种子含水量条件下秤锤树种子活力和生理生化指标的变化规律，探寻秤锤树种子的适宜贮藏温度和种子含水量，为秤锤树种子贮藏提供科学依据。【方法】将秤锤树种子脱水至2种不同的含水量（7.3%和10.1%），并贮藏在不同温度中（4 ℃和-18 ℃），共4种处理。对贮藏60、120、180、240、300 d的种子分别测定种子生活力和相对电导率、SOD活性、CAT活性、AsA含量、GSH含量、游离脯氨酸含量、O2·-含量、MDA含量、H2O2含量等生理生化指标。【结果】贮藏温度、种子含水量和贮藏时间协同影响秤锤树种子活力。随着贮藏时间的延长，各处理的种子生活力均下降；随着贮藏温度和种子含水量的下降，种子生活力显著提升；至贮藏结束300 d时，4种处理的种子生活力都保持在80%以上，特别是在含水量为7.3%贮藏在-18 ℃条件下，种子生活力达到了90%，显著高于其他处理。贮藏时间延长导致种子发生不同程度的劣变，不同处理下的种子相对电导率、O2·-含量、MDA含量、H2O2含量整体均呈逐渐上升的变化趋势；在贮藏前期游离脯氨酸含量升高，后期均有所下降；SOD活性、CAT活性、AsA含量、GSH含量整体均呈逐渐下降的趋势。采用模糊数学隶属函数值法综合分析不同处理中的秤锤树种子耐贮藏性结果为L/Lt>L/St>H/Lt>H/St。【结论】随着贮藏时间的继续延长，降低种子含水量和贮藏温度有利于减少贮藏过程中的劣变，提高种子抗氧化能力。同时，由模糊数学隶属函数值法综合评价得出L/Lt处理下种子贮藏性最强。综合分析贮藏效果，将含水量7.3%的秤锤树种子贮藏在-18 ℃温度下可能是保存该物种种质较为合适的方法。

关键词：秤锤树；种子贮藏；生理生化；种子活力

中图分类号：S792.99 文献标志码：A 文章编号：1673-923X（2024）12-0106-09

基金项目：江苏省珍稀乡土树种种质资源离体保护长期科研基地项目（LYKJ〔2021〕03）；江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）。

The effect of different storage conditions on physiology biochemistry and vigor of the Sinojackia xylocarpa seeds

CAI Hao， SHI Fenghou， SHEN Yongbao

（a. College of Forestry； b. Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China， Nanjing Forestry University， Nanjing 210037， Jiangsu， China）

Abstract：【Objective】Reveal the changing rules of the Sinojackia xylocarpa seeds viability and physiology and biochemistry indexes under different storage temperatures and seed moisture contents， identify the optimal storage temperature and seed moisture content of the seeds and provide scientific basis for the storage of the Sinojackia xylocarpa seeds.【Method】The seeds were dehydrated to two different seed moisture contents （7.3% and 10.1%） and stored at two different temperatures （4 ℃ and -18 ℃） across four treatment groups. Comprehensive assessments were conducted at intervals （60， 120， 180， 240， and 300 days）， measuring seed viability， Relative conductivity， SOD activity， CAT activity， AsA content， GSH content， free proline， O2·- content， MDA content， H2O2 content.【Result】Storage temperature， seed moisture content and storage time had synergistic influence seed vigor. With the extension of storage time， the seed viability of each treatment decreased； With the decrease of storage temperature and seed moisture content， seed viability increased significantly； By the end of storage 300 d， the seed of viability the four treatments remained above 80%， especially when the moisture content was 7.3% and stored at -18 ℃， the seed viability reached 96.6%， which was significantly higher than other treatments. Prolonged storage time led to the deterioration of seeds in different degrees， and the relative conductivity， O2·- content， MDA content and H2O2 content of seeds under different treatments showed a gradual upward trend. The content of free proline increased in the early stage of storage and decreased in the later stage. SOD activity， CAT activity， AsA content， GSH content all showed a decreasing trend. The fuzzy mathematical membership function method was used to comprehensively analyze seed storability of S. xylocarpa in different treatments， which was L/Lt>L/St>H/Lt>H/St.【Conclusion】With the extension of storage time， reducing the moisture content and lowering storage temperature can be conducive to reducing the deterioration during storage and improving the antioxidant capacity of seeds. At the same time， the comprehensive evaluation of the fuzzy mathematical membership function method showed that the seed storability was the most robust in L/Lt treatment. Based on the comprehensive analysis of the storage effect， we suggest that it may be the more suitable method to store the S. xylocarpa seeds with seed moisture content of 7.3% at -18 ℃.

Keywords： Sinojackia xylocarpa Hu； seed storage； physiology and biochemistry； seed viability

秤锤树Sinojackia xylocarpa Hu，为安息香科Styracaceae秤锤属Sinojackia的落叶灌木，是中国特有Ⅱ级濒危保护植物[1]。秤锤树的花洁白芬芳，果实形似秤锤，悬挂于树体，具有很高的观赏价值[2]。随着人为干扰的加剧，秤锤树的生境受到极大破坏，使得秤锤树种群数量锐减[3]。此外，秤锤树种子胚乳和内果皮的机械束缚，导致其种子在自然状态下很难萌发，这就加速了该物种的濒危[4]。因此，如果要拯救该物种免于野外灭绝，就需要进行有效的保护工作。将种子长期贮藏在种子库中是目前最佳方法之一，这是因为种子库可以在小空间内以最低成本长期安全保存遗传多样性[5]。目前，我国已经成功保护了濒危树种翠柏Calocedrus macrolepis的种子，它在种子库中贮藏了5年，仍然具有较高活力[6]。

种子的劣变取决于贮藏温度、种子含水量和贮藏时间[7]。即使在低温和低湿度条件下贮藏种子，其活力在长期贮藏过程中也会降低或丧失。据报道，种子活力丧失与某些细胞代谢和生化有关，包括脂质过氧化、酶失活、膜完整性破坏和DNA损伤[8]。虽然种子老化的确切机制尚不清楚，但活性氧（ROS）包括超氧阴离子自由基（O2·-）和过氧化氢（H2O2）的过量积累被认为是种子变质的主要原因[9]。丙二醛（MDA）是ROS的产物，是氧化损伤的生物标志物[10]。为了延长种子贮藏寿命，种子进化出高效的ROS清除系统，例如抗氧化酶和非酶抗氧化剂清除种子中过量积累的有害物质[9]。抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）可以清除种子在贮藏过程中积累的过量自由基，最大限度地减少ROS破坏作用。非酶抗氧化剂如抗坏血酸（AsA）和还原型谷胱甘肽（GSH）在清除ROS上起着关键的作用。同时，脯氨酸（Pro）也被证明可以消除ROS[11]。

以往对秤锤树的研究主要集中在种子生理[12]、染色体核型和比较形态学[13]等方面，至今尚未对秤锤树贮藏方法进行科学、系统地研究。本研究以不同含水量的秤锤树种子为对象，分析在不同贮藏条件下种子活力、有害物质、抗氧化系统及游离脯氨酸的相关变化。研究结果可能有助于为濒危物种秤锤树提供保存种质的方案，在一定程度上也能为其他乡土濒危树种的保护研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用秤锤树种子于2022年10月采收自江苏省句容市下蜀镇南京林业大学下蜀实习林场（119°13′30″E，32°7′33″N）。种子的横径为（24.5±2.6）mm，纵径为（13.3±2.0）mm，初始含水量40.3%。随后置于室温（10～25 ℃）下自然干燥至含水量10.1%与7.3%，并包装在塑料袋中，以便后续贮藏。

1.2 试验方法

当种子含水量降至目标量时，设置4种贮藏条件。H/St，含水量10.1%，贮藏温度（4±2）℃；H/Lt，含水量10.1%，贮藏温度（-18±2）℃；L/St，含水量7.3%，贮藏温度（4±2）℃；L/Lt，含水量7.3%，贮藏温度（-18±2）℃。贮藏时间为2022年12月至2023年11月，共贮藏300 d，每隔60 d取样1次，共取样5次，测定种子生活力和相对电导率、SOD活性、CAT活性、AsA含量、GSH含量、游离脯氨酸含量、O2·-含量、MDA含量、H2O2含量。

1.3 指标测定与数据分析

TTC参考De Barros Franca-Neto等[14]的方法测定，种子相对电导率采用DDS-11A型号电导仪测定，MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定[15]，脯氨酸含量测定采用酸性茚三酮显色法[16]，O2·-含量参考朱爱生等[17]的方法测定，SOD活性采用氮蓝四唑法测定，AsA采用GSH用分光光度计法测定，具体测定方法参照《植物生理学模块实验指导》[18]，CAT、H2O2采用南京建成生物工程研究所的试剂盒。

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 贮藏过程中种子活力的变化

由表1可知，贮藏温度、种子含水量、贮藏时间以及三者的交互作用对贮藏秤锤树种子生活力的影响均达到了显著水平（P<0.05）。由图1a可知，不同处理的秤锤树种子的生活力在贮藏过程中整体呈下降的变化趋势。在贮藏60 d时，H/St处理中种子生活力最高，其次是L/St，接着是H/Lt，最低是L/Lt。贮藏120 d后，L/Lt处理中的种子生活力显著高于其他处理组（P<0.05）。随着贮藏时间的延长，各处理种子的生活力不断下降，不同处理种子生活力差异逐渐增大。至贮藏结束（300 d）时，4种处理的种子生活力仍然可以保持在80%以上，特别是在L/Lt贮藏条件下，种子生活力达到了90%，显著高于其他处理（P<0.05）。H/St、H/Lt、L/St处理中贮藏的秤锤树种子生活力分别下降了16.7%、10%和7.3%。由图1b可知，在贮藏60 d时，H/St处理中种子相对电导率显著高于其他处理（P<0.05）。至贮藏结束300 d，H/St、H/Lt、L/Lt和L/St处理中种子相对电导率分别上升了28.7%、26.9%、24.6%和20.5%，其中H/St处理上升最多。在整个贮藏过程中，L/St处理中种子相对电导率显著低于其他处理（P<0.05）。试验结果表明，当秤锤树种子的含水量为7.3%时，-18 ℃环境中存放的种子贮藏效果明显优于其他处理，降低种子含水量和贮藏温度有助于秤锤树种子活力的保存。

2.2 贮藏过程中种子有害物质含量的变化

由表1可知，贮藏温度、种子含水量、贮藏时间以及3者的交互作用对贮藏秤锤树种子的相对电导率、MDA含量和H2O2含量的影响均达到了显著水平（P<0.05）。由图2可知，不同处理的秤锤树种子的相对电导率、MDA含量、O2·-含量和H2O2含量整体上均呈现上升趋势。由图2a可知，MDA含量至贮藏结束时达到了峰值，与贮藏60 d相比，H/St、H/Lt，L/Lt和L/St处理中贮藏秤锤树种子分别是贮藏60 d的2.1、2.3、1.7、1.2倍。由图2b可知，在贮藏60 d 时，L/Lt处理中O2·-含量显著高于其他处理（P<0.05）。至贮藏结束H/St处理组中O2·-含量是贮藏60 d的 2.2倍，并且显著高于贮藏300 d时的其他处理组（P<0.05）。由图2c可知，在贮藏初期，H/St和H/Lt处理组中H2O2含量明显低于L/Lt和L/St处理（P<0.05）。至贮藏240 d时，4种处理的H2O2含量不断增加，并且H/St和H/Lt处理中H2O2含量增加较快。至贮藏结束时，H/St、H/Lt、L/Lt和L/St处理中H2O2含量比贮藏60 d时分别增加了98%、75%、34%和15%。试验结果表明，贮藏温度和种子含水量越低，种子细胞膜被破坏程度越低，细胞膜完整性越高，种子有害物质积累也越少。其中，L/Lt处理中贮藏的种子效果最佳。

2.3 贮藏过程中种子抗氧化系统的变化

由表1可知，贮藏温度、种子含水量、贮藏时间以及三者的交互作用对贮藏秤锤树种子的SOD活性、CAT活性和GSH含量的影响均达到了显著水平（P<0.05）。贮藏温度、贮藏时间以及3者的交互作用对秤锤树中的AsA含量达到了显著水平（P<0.05），但种子含水量对其无显著影响（P>0.05）。由图3可知，不同处理的秤锤树种子的SOD、CAT、AsA和GSH在贮藏过程中整体上呈现波动下降的变化趋势。由图3a可知，在整个贮藏过程中，L/Lt处理的SOD活性显著高于其他处理，而H/St处理的种子生活力显著下降并且保持较低的SOD活性水平（P<0.05）。与贮藏60 d相比，贮藏结束时H/St、H/Lt，L/Lt和L/St处理中的SOD活性分别下降了35.5%、39.9%、34.6%和24.4%。由图3b可知，贮藏初期，H/St和L/St处理组中的CAT活性无显著差异，但均高于其他处理组（P<0.05）。随着贮藏时间的延长，L/Lt处理组中的CAT活性在120、180、240和300 d显著高于其他处理组（P<0.05）。贮藏60 d相比，贮藏300 d时H/St、H/Lt，L/Lt和L/St处理中的CAT活性分别下降了53.4%、40.6%、45.8%和37.3%。由图3c可知，在整个贮藏过程中，4种处理中的AsA含量总体变化幅度不大。其中，H/St处理组中的AsA含量在前180 d内显著高于其他处理组（P<0.05）。随着贮藏时间的延长，L/Lt处理组中的AsA含量逐渐升高，并显著高于（P<0.05）。由图3d可知，在贮藏60 d时，H/St处理组中的GSH含量显著高于其他处理组（P<0.05）。然而，随着时间的延长，L/Lt处理组中的GSH含量在180、240和300 d显著高于其他处理组（P<0.05）。至贮藏300 d时，H/St、H/Lt，L/Lt和L/St处理中的GSH含量分别是贮藏60 d的2.1、2.3、1.7、1.2倍。这些结果说明了，随着贮藏时间的延长，秤锤树种子内部的抗氧化酶和抗氧化剂不断下降，而降低含水和温度可以保持抗氧化酶的活性。

2.4 贮藏过程中种子游离脯氨酸含量的变化

由表1可知，贮藏温度、种含水量、贮藏时间以及交互作用对贮藏秤锤树种子游离脯氨酸含量的影响均达到了显著水平（P<0.05）。由图4可知，不同处理的秤锤树种子的游离脯氨酸含量在贮藏过程中呈现先上升后下降的变化趋势。贮藏60 d时，H/St中游离脯氨酸含量显著低于其他处理（P<0.05）。4种处理中的游离脯氨酸含量在贮藏240 d时达到了峰值，其中L/Lt处理最多，其次是H/St和L/St，H/Lt最少。至贮藏结束时，L/St和L/Lt处理无显著差异，且显著高于H/St和H/Lt处理。在整个贮藏过程中，L/Lt处理中的游离脯氨酸含量在贮藏期间保持较高水平。这些结果表明，秤锤树种子在含水量降低时会积累更多的游离脯氨酸，以缓解失水对种子细胞的损害；而低温条件则延缓了游离脯氨酸含量的减少，从而增强了抗衰老能力。

2.5 不同处理的秤锤树种子耐贮藏性综合评价

至贮藏结束时，秤锤树种子仍保持较高的生活力，说明秤锤树种子具有一定的耐贮藏性。现使用模糊数学隶属函数法，对4种处理秤锤树种子的10个生理指标的隶属函数加权平均值进行计算，综合评价不同处理秤锤树种子的耐贮藏性。各测试指标综合性评价分析结果（表2）表明，不同处理秤锤树的耐贮藏性强弱排序为L/Lt>L/St>H/Lt>H/St，即L/Lt处理中种子的隶函数值平均值最大，耐贮藏性最强；H/St处理中种子的隶函数值平均值最小综合，耐贮藏性最弱。

3 讨 论

3.1 贮藏过程中种子活力的变化

对于自然状态下萌发困难的秤锤树种子来说，很难通过发芽率快速地评估种子质量。然而，氯化三苯基四氮唑（TTC）法则不受种子休眠程度影响。采用TTC法测定野黍Eriochloa villosa种子在贮藏8 a期间的种子生活力，发现与发芽结果相一致[20]。因此，本试验采用TTC法来判断种子活力状况。总体上看，在4种处理下贮藏的秤锤树种子，在长达300 d的时间里保持较理想的生活力（80%以上）。在本研究中，随着贮藏时间的延长，秤锤树种子生活力不断下降，这也与南京椴Tilia miqueliana[17]、结缕草Zoysia japonica[21]和番茄Solanum lycopersicum[22]种子的研究结果相一致。随着贮藏时间的延长，L/St显著高于其他处理，表明种子含水量、贮藏温度和贮藏时间对种子活力有很大影响[22]。电导率测量被用于指示种子活力，并且是检测种子寿命的基本方法。原理是种子的衰老常伴随着细胞膜完整性丧失，膜通透性的变化可以通过电导率的变化来响应[23]。本研究发现，相对电导率和种子生活力结果大致相同。随着贮藏时间的延长，秤锤树种子浸出液的相对电导率不断上升，H/St处理下贮藏种子的相对电导率上升最快，而L/Lt贮藏条件下的种子细胞膜的伤害最小，种子活力相对电导率变化也最小，说明降低种子含水和温度可以有效地延长种子寿命。即在本试验范围内，将含水量7.3%的秤锤树种子贮藏在-18 ℃的环境中效果最佳。

3.2 贮藏过程中有害物质的变化

呼吸作用产生的ROS促进种子衰老，衰老又导致种子O2·-和过H2O2的积累[9]。此外，过量的ROS又引起脂质过氧化，导致MDA破坏细胞膜，进一步加速种子变质[11]。在我们的研究中，高含水量和贮藏温度产生更多的O2·-、H2O2和MDA，因此秤锤树种子活力下降的原因可归因于过量的O2·-、H2O2和MDA的积累。据报道，种子活力下降与翠柏[6]、向日葵Helianthus annuus[24]、欧洲山毛榉Fagus sylvatica[25]种子中高水平的O2·-、H2O2和MDA有关。本试验前期，4种处理中O2·-、H2O2和MDA含量都保持在很低的水平，说明抗氧化系统能够有效清除自由基等有害物质和抑制膜质过氧化反应，秤锤树种子有害物质还处于较低水平，贮藏后期种子的保护酶活性减弱，有害物质含量持续上升。4种处理中，种子的O2·-、H2O2和MDA含量的增加幅度不同，其中，H/ St处理中增加最大，L/Lt处理中增加最小，H/Lt和L/St中种子有害物质含量增加幅度介于两者之间。试验表明降低贮藏温度和种子含水量可以有效延缓种子的劣变，从而保持种子的活力。

3.3 贮藏过程中抗氧化系统的变化

为了降低ROS的浓度，植物组织中存在抗氧化防御系统[26]。这些保护系统由抗氧化酶与抗氧化剂组成，包括SOD、CAT、AsA、GSH等[27]。SOD是细胞防御ROS最重要的酶之一[28]，可以将机体代谢产生的O2·-等转化为H2O2，CAT将H2O2还原为水[29]。已有研究中向日葵种子[24]、大豆[30]、棉花Gossypium hirsutum[31]在贮藏过程中SOD和CAT活性有不同程度的下降趋势，这与本研究相一致。种子含水量和贮藏温度的增加，加速酶氧化并导致细胞损伤，从而降低种子活力。在本试验范围内，L/Lt处理的SOD活性和CAT活性在贮藏期间均高于其他处理。这可能是因为降低种子含水量和贮藏温度对L/Lt处理中的秤锤树种子产生胁迫，种子为了适应环境从而大幅提升SOD和 CAT酶活性。而在贮藏后期，种子内的有害物质缓慢增加，SOD和CAT酶活性随之缓慢减少。此外，AsA是一种非常重要的抗氧化剂，可与OH-、O2·-和原子氧直接反应[32]。谷胱甘肽作为氧化还原系统中重要的还原剂和调节信号分子，在清除ROS中发挥重要作用[11]。在本试验范围内，贮藏结束，秤锤树种子的GSH和AsA含量相比贮藏前显著降低，且种子含水量和贮藏温度越高，贮藏后种子活力越低，酶活性越低。因此，保持较高的抗氧化酶活性以及ROS清除能力是L/Lt处理中的秤锤树种子活力较强的原因之一。

3.4 贮藏过程中游离脯氨酸含量的变化

Pro可以通过清除H2O2来保护细胞功能，并在响应氧化应激中发挥重要作用[33]。本研究中，L/Lt处理的游离脯氨酸含量显著高于其他处理组，表明Pro在L/Lt处理中对清除H2O2起到了重要作用。L/Lt处理中H2O2含量较低和生活力较高进一步支持了这一结论。在贮藏初期到180 d的L/Lt处理中游离脯氨酸含量较高是对不利贮藏条件的适应性反应，游离脯氨酸含量的增加是一种防御机制，可能对受胁迫的植物有益。从180 d到贮藏结束，H/St、H/Lt和L/St处理中游离脯氨酸含量的下降可能是由于H2O2大量积累。因此，降低贮藏温度和种子含水量可以增加游离脯氨酸含量，增强种子对不利环境的适应力。

3.5 秤锤树种子耐贮藏评价

在种子贮藏的过程中，其内部会发生较为复杂的生理变化。因此，仅从单项指标难以准确衡量种子耐贮藏性。隶属函数法可以综合多项生理生化指标，对胁迫中不同的植物做出较好的综合评价[19]。吕艳贞等[34]利用隶属函数法对紫花苜蓿Medicago sativa种子耐贮藏性进行综合评价，并成功筛选出耐贮藏性强的种质。本研究利用隶属函数分析法对不同处理中秤锤树种子的耐贮藏性进行综合评价，各处理种子耐贮藏性排序依次为L/Lt>L/St>H/Lt>H/St，即L/Lt处理中种子的耐贮藏性最强。该方法所获得的结论提高了秤锤树种子耐贮藏性评价的全面性和客观性。

种子含水量和贮藏温度对贮藏期间的种子寿命有很大影响[35]。已有研究表明，种子含水量每减少1%或者贮藏温度每下降5 ℃，种子寿命就会增加1倍[36]。在本试验中，降低种子含水量和贮藏温度可以显著提高秤锤树种子的抗氧化性，延长其寿命。然而，本试验初步探讨了秤锤树种子在4种不同贮藏条件下，300 d内的种子活力变化，贮藏时间相对较短。在今后的研究中，可以在此基础上延长秤锤树种子的贮藏时间，继续观测种子的活力变化，从而更准确地判断秤锤树种子的最佳贮藏含水量和贮藏温度及最长贮藏时间。此外，本研究主要集中于几种核心的生理和生化指标，未能涵盖更广泛的分子层面的变化。为了深入理解种子贮藏过程中的复杂生理机制，未来的研究可以采用更先进的生物技术手段，如转录组学、蛋白质组学和代谢组学分析，以全面评估4种贮藏条件对种子生理状态的影响。通过这些综合方法，可以更准确地研究影响种子耐贮藏性的关键因素，从而为种子的长期保存和利用提供科学依据和技术支持。

4 总 结

本研究初步探索了不同贮藏条件对秤锤树种子活力及其生理生化反应的影响。在秤锤树种子贮藏过程中，随着贮藏时间的延长，秤锤树种子活力逐渐下降；经过300 d贮藏后，在L/St处理（即含水量7.3%，贮藏温度为-18 ℃）中贮藏的生活力最高，为96.6%。相比其他贮藏条件，在L/St处理中贮藏的种子相对电导率上升较为平缓。各贮藏处理条件下，随着贮藏时间的延长，O2·-、H2O2、MDA含量逐渐增加，抗氧化酶SOD、CAT活性、非酶抗氧化剂GSH和ASA含量不断上升，而游离脯氨酸含量先上升后下降。然而，随着种子含水量和贮藏温度的降低，有害物质的产生在一定程度上受到抑制，使种子寿命得以延长。利用隶属函数分析法综合评价不同处理中秤锤树种子的耐贮藏性，排序为L/Lt>L/St>H/Lt>H/ St。综上所述，在-18 ℃下且含水量为7.3%的条件下贮藏秤锤树种子可能是保存该物种种质最合适的方法。本研究不仅筛选出了适宜秤锤树种子的贮藏方法，同时也深入揭示了其劣变过程中的生理生化机制。

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[本文编校：戴欧琳]