炮制对卷柏活性成分及体外抗氧化和止血作用的影响

摘 要：研究了炮制对卷柏生物活性成分含量及其体外抗氧化活性及止血作用的影响．结果表明：随着炮制温度逐渐升高和时间的增加，生卷柏原药样中的化合物组分会发生热降解或热分解，穗花双黄酮含量降低，总黄酮含量下降，总酚和鞣质含量呈上升趋势．生品卷柏被炮制为炭品后，部分色谱峰消失，其中卷柏炒炭药样中11个共有峰的总面积仅为生品卷柏的5.30%；从生品到炭品，其抗氧化能力降低了55.58%；但炒炭卷柏药样的止血能力较生品增强，体现了中药“炒炭存性”的炮制原则．

关键词：高效液相色谱；卷柏；炮制；抗氧化活性；止血作用

中图分类号：R 945" 文献标识码：A" 文章编号：1007-6883（2024）06-0052-08

DOI：10.19986/j.cnki.1007-6883.2024.06.008

卷柏Selaginella tamariscina（Beauv．）Spring，是卷柏科（Selaginellaceae），卷柏属（Selaginella）土生或石生复苏植物，又名九死还魂草、回阳草．全草入药，味辛、涩，性平［1］．卷柏为2020年版《中国药典》收载的常用中药，有清热利尿、破血散瘀、活血止血等功效［2］．且适用于治疗急性传染性肝炎、胸胁腰部的挫伤和全身浮肿等症，主要分布于我国长江流域、长江以南各省及陕西南部、甘肃、台湾等地［3］．卷柏属植物的化学成分比较复杂，目前己从该属植物中分离得到黄酮类［4］、炔酚类［5］、苯丙素类和有机酸类［6］等化合物．其中以穗花杉双黄酮（Amentoflavone）为代表的双黄酮类成分最为广泛［7］，该类成分含量较大，种类繁多，是卷柏属植物最主要的活性成分之一［8-9］．现代药理及临床研究表明卷柏有防癌治癌、抗炎、抗病毒、镇痛、降血压、降血糖和增强人体免疫功能等作用［9］．

卷柏生用可以破血，炒炭后可化瘀止血，常用于吐血、崩漏、便血和脱肛等症［10］．《证类本草》云：“生用破血，炙用止血”．表明了卷柏经过炮制之后，其药性发生了明显的变化．炮制作为中医药独有的制药技术，主要为了缓和或改变药性，使活性成分含量增加，毒性成分含量减少，降低或去除毒副作用及增强药效［11］．常见的炒法炮制是直接将生药置于一定温度的锅中加热炒制为表面呈黄色（炒黄品）、或焦褐色（炒焦品）、或焦黑色（炒炭品）［12］．炒制过程中药材由于受到温度、水分和空气氧等因素的影响，常伴随着其中诸多有效化学成分的变化．李根林［13］及吴彩霞［14］等分别比较了生卷柏与卷柏炭的总黄酮及其双黄酮的含量，杨瑞芳等［15］比较了卷柏炒炭前后的止血作用．炮制程度（炒黄、炒焦和炒炭）对卷柏的化学成分及其生物活性的影响尚未见文献报道．本文以生卷柏为原药，经过不同程度的炮制，制备炒黄卷柏、炒焦卷柏和炒碳卷柏，利用HPLC法和亮度法测定了炮制对其指纹图谱及穗花杉双黄酮、总黄酮、总酚和鞣质含量的影响，并对其体外抗氧化和止血作用进行了研究，以期为卷柏炮制的深入研究提供参考．

1 材料与方法

1.1 实验材料

中药卷柏、云南白药：购于市区中药店．新鲜牛血：在当地畜牧屠宰场并于实验当日获取．

1.2 实验试剂

乙醚、甲醇、氢氧化钠、氯化钠、硝酸铝、碳酸钠、亚硝酸钠、硝酸钠、芦丁、无水乙醇、95%乙醇、干酪素、单宁酸、硝酸铝、磷酸、福林酚、DPPH、硫酸亚铁和过氧化氢等试剂均为AR级，乙腈为色谱纯（广州化学试剂公司），穗花杉双黄酮和芹菜素为色谱纯（上海阿拉丁试剂有限公司）．

1.3 仪器与设备

BSA124S-CW电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；T6新悦可见分光亮度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；XZL-01炒锅（星知鹭有限公司）；YK-12中药粉碎机（山东省青州益康中药机械有限公司）；JP-060超声波清洗仪（深圳市洁盟清洗设备有限公司）；N-1200B旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；H1B50R离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；1100-AB 4000液相色谱仪（美国Agilent公司）．

1.4 方法

1.4.1卷柏炮制

生卷柏：取干燥后的卷柏药材，剪成小段，去除根与杂物，粉粹并过40目筛，为生卷柏供试样品．炒黄卷柏：取去根后净生卷柏段，置于锅内用文火炒至表面为淡黄色，取出，自然冷却至室温．焦卷柏：取上述净生卷柏段，用文火炒至表面焦黄色，取出，自然冷却后干燥保存．卷柏炭：取上述净生卷柏段，用中火炒至表面焦黑色，取出，自然冷却后干燥保存．

1.4.2 卷柏及其炮制品的HPLC指纹图谱研究

1.4.2.1 对照品溶液的制备

精密称取适量的穗花杉双黄酮对照品，加甲醇制成标品样液，1 mL样液约含0.5 mg穗花杉双黄酮，备用．

1.4.2.2 供试品溶液的制备

分别取生卷柏、炒黄卷柏、焦卷柏和卷柏炭四种供试样品粉末各2 g，精密称定，置锥形瓶中，加甲醇25 mL，超声提取120 min，滤过，回收溶剂．加甲醇定容在50 mL容量瓶．用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，对每个待测供试品，同法制备平行样液三份，备用．

1.4.2.3 色谱条件

色谱柱ZORBAX SB C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），色谱梯度洗脱条件如表1所示．进样量：10 μL，检测波长330 nm，柱温为室温．

1.4.3 供试品中总黄酮的测定

卷柏及其炮制品分别用85%（V/V）甲醇制备待测样液，并参考贺锋嘎等［16］的方法测定总黄酮．

1.4.4 供试品中总酚与鞣质含量的测定

卷柏及其炮制品分别用70%（V/V）乙醇制备待测样液，并参考高麦瑞等［17］福林酚法及张宇喆等［18］的方法分别测定总酚与鞣质含量，并按照下列公式计算：鞣质含量=总酚量-不被吸附的多酚量．

1.4.5 供试品体外抗氧化活性测定

分别将生卷柏、黄卷柏、焦卷柏和炭卷柏过60目筛备用，分别取2.0 g生卷柏粉末及其三种炮制品粉末用20 mL 70%的乙醇溶解后，放入超声波清洗器中，功率为100 Hz，以超声波法提升黄酮的提取效果，温度设置为60 ℃，时间120 min．抽滤得到澄清的提取液．DPPH自由基清除率参考张浩等［19］和赵立春等［20］的方法进行．

精密称取DPPH粉末2.0 mg，配置成60 μmol/L DPPH溶液．分别精密移取生卷柏样品和炮制样品的提取液各0.1 mL，分别加入60 μmol/L的DPPH溶液2 mL，混匀后室温放置3 min，以70%乙醇为空白试剂调零点，取样品溶液在517 nm处测吸光度为[A1]；取样品溶液0.1 mL加2 mL溶剂，混匀后测定吸光度为[A2]；取样品溶液0.1 mL加2 mL DPPH溶液，混匀后测定吸光度为[A3]．按下述公式计算：DPPH自由基清除率（%）=[[1-（A1-A2/A3]×100]，其中[A1]为样品对DPPH作用后的吸亮度，[A2]为样品自身对吸亮度的贡献，[A3]为DPPH本身在测定波长的吸亮度．

1.4.6 供试品的体外止血作用

1.4.6.1 中药水提物的制备

采用内部沸腾法制备水提物［21］．各称取5.0 g样品粉末用24 mL 70%乙醇溶液湿润均匀，加盖静置30 min后迅速加入100 mL沸腾蒸馏水，水浴提取1 min，过滤；第二次提取物料为第一次提取所得滤渣，用同上体积的沸腾蒸馏水水浴提取5 min，最后减压抽滤并合并滤液，每个样品药液含原药材为0.03 g/mL；云南白药处理同上．

1.4.6.2 玻片法测凝血时间

滴牛血于清洁培养皿上，血滴直径为5～10 mm．随机分成3组，每组8份．分别加入卷柏的生品及其炮制品的和云南白药水提物、生理盐水，用秒表准确记录凝血时间．期间用干燥针头挑动血液观察凝血情况，直至能挑起纤维蛋白丝为止，即为凝血时间，计算凝血时间缩短率［22］．

止血时间缩短率（%）=（空白组凝血时间-给药组凝血时间）/空白组凝血时间[×]100．

1.5 数据处理

每个指标平行测定3次．实验结果用Excel和SPSS软件对数据进行统计学分析，指标值测定结果以平均值±标准偏差表示．

2 结果与分析

2.1 炮制对卷柏提取物的HPLC指纹图谱的影响

通过穗花双黄酮标准品、生卷柏、炒黄卷柏、焦卷柏和卷柏炭甲醇提取液的HPLC指纹图谱分析．四种卷柏样液的指纹图谱有11个共有峰，其中7号峰对应的是标准品穗花双黄酮．卷柏及其炒制品甲醇提取液指纹图谱共有峰及其峰面积见表2．

由表2可知，从生卷柏®炒黄卷柏®焦卷柏®卷柏炭，随着炮制程度加深，共有峰1、2、7、8、10和11号的峰面积均逐渐降低（其中8和11号峰面积均显示“降®降®消失”），而且在生卷柏中占共有峰总面积的90%以上；3号共有峰面积显示“升®降®升”、4号共有峰面积为“降®升®升”、5和6号共有峰面积为“升®升®降”、9号共有峰面积为“升®升（峰值）®消失”．

2.2 炮制对卷柏总黄酮含量的影响

不同炮制品卷柏的HPLC指纹图谱中7号峰为穗花杉双黄酮，其峰面积在生卷柏中占60%以上，表明穗花双黄酮是卷柏中主要化学成分．卷柏黄酮有穗花杉双黄酮、芦丁、槲皮素、山柰酚、木犀草素和芹菜素及糖苷等化合物．炮制对卷柏中总黄酮含量的影响见图1．炒黄卷柏、炒焦卷柏和炒炭卷柏中总黄酮含量较生卷柏分别减少了14.34%、8.61%和62.13%．由此可知，随着炮制程度的加大，样液中总黄酮的变化呈现波动下降趋势．

2.3 炮制对卷柏总酚的含量的影响

炮制对卷柏中总酚含量的影响见图2．生卷柏、炒黄卷柏、炒焦卷柏和炒炭卷柏的提取液中的总酚浓度为0.159 mg/mL、0.163 mg/mL、0.268 mg/mL和0.160 mg/mL．在一定的温度和时间下，卷柏炮制品的总酚含量呈现先升高再降低的趋势，而炒焦卷柏的总酚含量最高．

2.4 炮制对卷柏中鞣质含量的影响

炮制对卷柏中鞣质含量的影响如图3所示．三种炮制品——炒黄卷柏、炒焦卷柏和炒炭卷柏的鞣质的含量比生品分别增加了10.00%、90.91%和57.14%，炭卷柏的鞣质比焦卷柏低，与文献报道的一致［23］．

2.5 体外止血实验结果与分析

不同炮制卷柏样品对体外牛血的凝血时间的影响见表3．体外凝血作用数据分析表明：生卷柏与炒黄卷柏及炒焦卷柏的体外凝血作用的差异性不显着，与炒炭药样的差异性显着，表明了碳品的止血能力比相应的生品及炒黄和炒焦卷柏均强，与文献报道［10，24］结果一致．

2.6 炮制对卷柏抗氧化活性影响

炮制对卷柏中提取物的自由基清除能力的影响见图4．生卷柏、炒黄卷柏、炒焦卷柏和炒炭卷柏提取物的自由基清除率分别为24.403%、24.521%、25.052%和10.841%．适当炮制，其药物的抗氧化活性略有增加，但差异性不显着；但炮制成碳品后，其抗氧化活性会大大降低．随着炮制程度的加大，其药样的体外止血作用出现逐渐的增强，而且卷柏炭平均凝血时间与生卷柏、炒黄卷柏和炒焦卷柏存在显着性差异．

炮制后卷柏各种活性物质与抗氧化能力之间的相关性见表4，结果表明抗氧化活性与其所含的总黄酮、总酚和鞣质均具有正相关性；其中DPPH自由基清除能力与鞣质含量及总酚含量呈弱相关，而与总黄酮则为极强相关．

3 讨论

炒制是中药炮制的常用方法之一，因为其炮制方法简单得以广泛应用．卷柏在炒黄、炒焦和炒炭三种炮制操作中，不需添加任何辅料，直接将卷柏生品置锅中加热炒至适宜程度．随着炮制的火候（温度）逐渐升高和时间延长，生品卷柏中的化学成分产生许多的化学变化，导致穗花双黄酮含量降低、总黄酮含量呈下降趋势、总酚和鞣质含量呈上升趋势，这种内含物的变化，使得炒炭卷柏抗氧化作用与其它三种产生了显着的差异性，也体现了中药炮制过程的“炒炭存性”［25］，亦验证了唐氏《血证论》中“血之为物，热则行，冷则凝，见黑则止，遇寒亦止”．古人认为红属火、黑属水，五行相克规律中“水克火”即“黑克红”，因此有“以黑胜红”“红见黑则止”的论述［26］，有认为“烧灰诸黑药皆能止血”［27］．因此传统中医以黑色之品治呕血、吐血、咯血、漱血，充分体现了中医的五行中以水克火之功．临床也多将药物烧炭（如血余炭、大蓟炭、小蓟炭等）之后入药，以求止血之功［28］．

现代医学认为多数止血药通常是多途径发挥止血效果，如收缩血管，降低毛细血管通透性，激活凝血因子，促进血小板生成、黏附、聚集，抗纤维蛋白溶解等使凝血时间、凝血酶原时间、出血时间缩短等［29-30］．故可以推断：卷柏炒炭后，其凝血作用的增强与鞣质含量的增多相关．鞣质在内服或外用时，具有止血和收敛作用，并能收缩微血管［30］．其特性是易和蛋白质结合形成大分子物质，在血管破损的地方形成硬块，阻止血液外流，达到止血的目的［31］．据文献［32-35］报道黄酮类化合物（芦丁、槲皮素）炒炭后可转化为具有止血作用的鞣质，使鞣质含量增加，止血作用增强．刘凤鸣［36］等的药理研究表明，黄酮类化合物具有改善微循环，提高体内cAMP水平，防治冠心病、高脂血症和心肌梗塞等作用，是抗血小板聚集的主要有效成分之．卷柏炒炭后，具活血化瘀作用的有效成分总黄酮含量减少，则止血作用可相对增加，验证了中药卷柏“生则能行，熟则能止”的论述．此外，炒制高温下草酸钙晶体转变为游离钙离子、及其碳素等因素密切相关［31］，而钙离子也是凝血因子Ⅳ，不仅参与血液凝固的多个环节，其浓度还影响着血小板的活化血小板活化后在损伤部位形成闭塞性聚集体，从而使血管破裂导致的出血自发停止［37］．而碳素为疏松多孔的内部结构，具有物理性吸附的作用，与血液接触之后能够激活其中的凝血因子，使血小板裂解并释放血小板因子，从而促进血液凝固［31，38］．卷柏炭药的凝血与其钙离子和碳素的关系有待进一步研究．

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The Effects of Processing on the Active Components

and In Vitro Antioxidant Activity and Hemostasis

of Selaginella tamariscina

GUO Shou-jun，YANG Dong-juan，CHEN Zi-ruo，LING Ya， GUO Ying-ying，

YANG Yong-li*

（College of Life Sciences and Food Engineering， Hanshan Normal University， Chaozhou， Guangdong， 521041）

Abstract：The effects of processing on the content of bioactive components and in vitro antioxidant activity and hemostasis of Selaginella tamariscina were studied．The result showed that as the processing temperature gradually rose and the time increased，the compound components in the raw sample of Selaginella tamariscina would undergo thermal degradation or thermal decomposition，the content of amentoflavone decreased，the total flavonoid content decreased，and the content of total phenols and tannins showed an upward trend．After being processed into charcoal，some chromatographic peaks disappeared，and the total area of 11 common peaks in the roasted charcoal sample of Selaginella tamariscina was only 5.30% of that of raw Selaginella．From the raw product to the charcoal product，its antioxidant capacity decreased by 55.58%．However，the hemostatic ability of the roasted charcoal sample is enhanced compared to the raw product，reflecting the processing principle of the traditional Chinese medicine’s“preservation of roasted charcoal”．

Key words：HPLC；Selaginella tamariscina；processing；antioxidant activity；hemostasis

责任编辑 周春娟