五谷虫通过抑制免疫应激-补体活化缓解咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮肤损伤

关键词：五谷虫；银屑病；免疫应激；补体活化；炎症反应

银屑病（PSO）是免疫介导的慢性、复发性、炎症性、系统性疾病，全球发病率2%～3%，临床表现为鳞屑性红斑或斑块，全身局限或广泛分布［1， 2］。PSO是由多种细胞及因子共同作用介导的免疫紊乱［3］，机体发生过度免疫反应，B细胞过度分化成浆细胞分泌大量免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）［4， 5］，IgG、IgM与抗原结合形成免疫复合物激活补体系统经典途径，产生补体成分3a（C3a）和补体成分5a（C5a）［6］，C3a/C5a与其受体结合诱导细胞分泌白细胞介素-23（IL-23）、白细胞介素-17（IL-17）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎性因子［7， 8］，最终导致PSO皮损。

中药五谷虫又名蝇蛆，为丽蝇科常见医学昆虫丝光绿蝇或其近缘动物的幼虫或蛹壳。五谷虫始载于《本草纲目》，列于虫部第四十卷，其味咸、甘，性寒，归脾、胃经，具有清热、消滞、除疳等功效，临床上可用于去热、治热病、治臁烂等［9］。研究表明，五谷虫中所含化学成分包括蛋白质类、脂肪酸类、甲壳素类等，并发现其具有调节免疫、抗炎、促创面愈合及组织重建和再生等药理作用［10］，且其是通过美国食品药品监督管理局认证的首批、唯一的医疗用昆虫［11］。然而，目前五谷虫治疗PSO的研究较少，通过免疫应激-补体活化途径治疗PSO的药效学及作用机制尚未见报道。因此，本研究通过咪喹莫特（IMQ）乳膏诱发构建PSO小鼠模型，研究五谷虫调控免疫应激-补体活化途径治疗PSO的药效学及作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性C57BL/6小鼠36只，6～8周龄，体质量20～25 g，购自成都达硕实验动物有限公司［许可证号：SCXK（川）2020-0030］。小鼠分笼饲养，温度22±2 ℃，湿度55%～75%，光照12 h昼夜周期循环，自由饮水、摄食，所有小鼠在实验前先适应环境1周。本实验符合动物实验伦理规范，经陕西中医药大学动物实验伦理委员会审核并批准（伦理批号：SUCMDL20240124001）。

1.1.2 主要试剂与仪器 五谷虫软膏（实验室自研），IMQ乳膏（明欣利迪），本维莫德乳膏（欣比克），凡士林乳膏（昭诺）；IgG、IgM、血清总补体（CH50）、补体成分1s（C1s）、补体成分3（C3）、C3a、补体成分5（C5）、C5a、IL-23、IL-17A、TNF-α ELISA检测试剂盒（酶联生物）；锌合金数显卡尺（上海美耐特实业有限公司）；恒温摇床（上海一恒科学仪器有限公司）；酶标仪（深圳迈瑞生物医疗有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠PSO模型及分组 36 只C57BL/6 小鼠随机分为正常组，模型组，五谷虫低剂量（1.25%）、中剂量（2.5%）、高剂量（5%）组，本维莫德（1%）组，6 只/组。实验第0 天将小鼠背部皮肤脱毛，24 h 后在正常组小鼠背部皮肤及右耳耳廓内外侧涂抹凡士林乳膏，1次/d，连续8 d；其他各组小鼠背部皮肤及右耳耳廓内外侧涂抹IMQ乳膏，1 次/d，连续8 d。实验第4 天起，给药组小鼠背部皮肤及右耳耳廓内外侧涂抹IMQ乳膏，4 h前、后涂抹不同剂量五谷虫和本维莫德乳膏，2 次/d，连续5 d。

1.2.2 MPASI 评分法 采用改良的MPASI 法评估小鼠背部皮肤损伤的严重程度。皮损面积评分将小鼠分为头部、上肢、躯干、下肢、尾部共5个部分，拟定分别占据体表总面积的20%、10%、50%、10%、10%，采用Ah、Au、At、Al、Ae表示小鼠各部分皮损占相应皮肤表面的波及程度，采用0～6分的七级评分法表示。皮损严重程度评分以红斑、浸润、鳞屑进行描述，采用0～4分的五级评分法表示。在MPASI分值计算中，因模型为小鼠背部药物刺激诱导建模，皮损主要局限于小鼠的背部，即躯干部位，其余结构的皮损均为0，所以计算小鼠的MPASI分值应为躯干部的红斑（E，0～4分）、浸润（I，0～4分）、鳞屑（D，0～4 分）与躯干所占总体表面积的系数（50%）和躯干部累及皮损的面积比例（A，0～6 分）的乘积，即MPASI=0.5（Et +It+Dt）At，其最小值为0 分，最大值为36分（表1）。

1.2.3 检测小鼠耳廓肿胀厚度 实验第1、9天，游标卡尺测量小鼠右耳耳廓厚度，测量3 次取均值，测量时尽量选择靠近耳缘部位的耳中部皮肤，避免测量耳根部皮肤褶皱引起实验误差。耳廓肿胀厚度增加量（mm）=第9天耳廓厚度（mm）-第1天耳廓厚度（mm）。

1.2.4 HE染色检测小鼠组织病理学变化 取小鼠背部皮肤组织和右耳组织，4%多聚甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋，连续厚4 μm切片，HE染色后封片。光学显微镜下评估PSO的组织病理学特征，包括过度角化、颗粒层变薄或消失、棘层肥厚、表皮波浪状起伏并向真皮下延伸，以及炎性细胞浸润等。

1.2.5 观察小鼠抓挠行为学 通过观察小鼠10 min内抓挠次数判断各组小鼠皮肤的瘙痒严重程度。将小鼠置于透明观察笼中，适应10 min后，在安静环境下持续拍摄记录小鼠10 min内的挠痒情况，统计小鼠抓挠次数。小鼠举起前后爪、用嘴咬、挠耳朵连续抓挠造模区域1次或多次，然后将前后爪落在地上或收回时代表1次抓挠结束。前后爪、用嘴咬抓挠涂抹部位以外的其他部位皮肤不进行计数。

1.2.6 计算小鼠脾脏指数 称量小鼠体质量，分离得到的脾脏，去除周围多余组织，于生理盐水中清洗去除血污，滤纸吸干水分，电子天平称量脾脏质量，计算脾脏指数。脾脏指数=脾脏质量（mg）/小鼠体质量（g）。

1.2.7 甲苯胺蓝染色检测小鼠组织肥大细胞数量 取小鼠背部皮肤组织，4%多聚甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋，连续厚４μm切片，用甲苯胺蓝染色后封片。光学显微镜下观察肥大细胞数量并计数。

1.2.8 ELISA法检测 小鼠眼眶采血，室温静置30 min后，3500 r/min离心10 min，分离血清，血清收集于1.5 mLEP管中，取1.2.4、1.2.7 剩余小鼠背部皮肤组织，-80 ℃保存。按照ELISA试剂盒说明书分别检测免疫应激（IgG、IgM）、补体活化（CH50、C1s、C3、C3a、C5、C5a）、炎症反应（IL-23、IL-17A、TNF-α）相关因子水平。

1.3 统计学分析

采用Graphpad Prism8.0.2 软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间样本均数的两两比较采用Sidak法，Plt;0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 五谷虫降低PSO小鼠MPASI评分

与正常组相比，模型组小鼠造模处皮肤皮损肥厚，出现较多鳞屑且有红色斑痕，皮肤损伤严重，MPASI评分升高（Plt;0.001，图1）；与模型组相比，五谷虫低、中、高剂量及本维莫德组小鼠皮肤损伤均有缓解，皮损组织厚度变薄，鳞屑和红色斑痕减少，MPASI 评分降低（Plt;0.001，图1），五谷虫疗效呈现剂量-效应依赖关系。

2.2 五谷虫减少PSO小鼠耳廓肿胀厚度

与正常组相比，模型组小鼠造模处右耳耳廓出现较多鳞屑，耳廓肿胀厚度增加（Plt;0.001，图2）；与模型组相比，五谷虫低剂量组，中、高剂量及本维莫德组小鼠右耳耳廓鳞屑减少，耳廓肿胀厚度减少（Plt;0.05，图2），五谷虫疗效呈现剂量-效应依赖关系。

2.3 五谷虫改善PSO小鼠背部皮肤和右耳组织病理学变化

小鼠背部皮肤组织和右耳组织HE染色结果显示（图3），正常组表皮结构完整清晰，表皮层较薄，细胞排列较为整齐紧密；真皮内胶原纤维交错排列，胞质红染、均匀；结缔组织与脂肪层结构清晰可见；皮下肌层肌纤维排列整齐，体积大小均一，细胞核形态正常，核仁多分布四周，未见明显病理变化。与正常组相比，模型组角质层过度角化、角化不全，颗粒层变薄或消失，表皮层棘层肥厚，表皮突延长、起伏，真皮层单核及多核细胞浸润，乳突上顶。与模型组相比，五谷虫低、中、高剂量及本维莫德组角质层过度角化、角化不全，颗粒层变薄或消失，表皮层棘层肥厚，表皮突延长、起伏，真皮层单核及多核细胞浸润，乳突上顶等情况均有所改善。

2.4 五谷虫改善PSO小鼠抓挠行为学

与正常组相比，模型组小鼠皮肤瘙痒程度严重，精神烦躁不安，抓挠、撕咬、舔舐造模区域皮肤等行为次数增多（Plt;0.001，图4）；与模型组相比，五谷虫低剂量组，中、高剂量及本维莫德组小鼠的皮肤瘙痒程度得到改善，抓挠、撕咬、舔舐造模区域皮肤等行为次数减少（Plt;0.01，图4），五谷虫疗效呈现剂量-效应依赖关系。

2.5 五谷虫降低PSO小鼠脾脏指数

与正常组相比，模型组小鼠脾脏颜色变黑，体积肿大明显，脾脏指数升高（Plt;0.001，图5）；与模型组相比，五谷虫低、中、高剂量及本维莫德组小鼠脾脏体积明显缩小，脾脏指数降低（Plt;0.001，图5），五谷虫疗效呈现剂量-效应依赖关系。

2.6 五谷虫减少PSO小鼠组织肥大细胞数量

与正常组相比，模型组小鼠组织肥大细胞数量增加（Plt;0.001，图6）；与模型组相比，五谷虫低剂量组，中、高剂量组及本维莫德组小鼠组织肥大细胞浸润情况改善，肥大细胞数量减少（Plt;0.01，图6），五谷虫疗效呈现剂量-效应依赖关系。

2.7 五谷虫降低PSO小鼠免疫应激相关因子水平

与正常组相比，模型组小鼠血清IgG 水平升高（Plt;0.001），IgM水平有升高趋势，但差异无统计学意义（图7）；与模型组相比，五谷虫高剂量及本维莫德组小鼠血清IgG水平降低（Plt;0.01，图7）。

2.8 五谷虫降低PSO小鼠补体活化相关因子水平

与正常组相比，模型组小鼠血清CH50、C3、C5 水平降低（Plt;0.001，图8A～C），C1s、C3a、C5a 水平升高（Plt;0.001，图8D～F）；与模型组相比，五谷虫高剂量组小鼠血清CH50、C3、C5 水平升高（Plt;0.01，图8A～C），C1s、C3a、C5a 水平降低（Plt;0.05，图8D～F）；本维莫德组小鼠血清CH50、C3 水平升高（Plt;0.05），C5 水平有升高趋势，但差异无统计学意义（图8A～C），C3a、C5a水平降低（Plt;0.05），C1s 水平有降低趋势，但差异无统计学意义（图8D～F）。

与正常组相比，模型组小鼠组织C1s、C3、C3a、C5、C5a水平升高（Plt;0.05，图8G～K）；与模型组相比，五谷虫高剂量组小鼠组织C1s、C3、C3a、C5、C5a水平降低（Plt;0.05，图8G～K）；本维莫德组小鼠组织C1s、C3a、C5a水平降低（Plt;0.05），C3、C5水平有降低趋势，但差异无统计学意义（图8G～K）。

2.9 五谷虫降低PSO小鼠炎症反应相关因子水平

与正常组相比，模型组小鼠血清IL-23、IL-17A、TNF-α水平升高（Plt;0.01，图9）；与模型组相比，五谷虫高剂量及本维莫德组小鼠血清IL-23、IL-17A、TNF-α水平降低（Plt;0.05，图9）。

3 讨论

中医称PSO为“白疕”，多因情绪不畅或饮食失节、素体阳热偏盛，加之外感邪毒，毒热入血而发病，临床辨证多从血论治。隋·巢元方所著《诸病源候论》记载，PSO病机发生发展在“血热”的基础上，与“毒”“瘀”“虚”密切相关，热邪壅盛产毒，久病入络成瘀，慢性反复发作性疾病本质为虚，治疗以清热解毒，活血化瘀，调和气血为主要原则［12］。五谷虫其味咸、甘，性寒，具有清热，消滞等功效［9］，可能通过清血之热毒，化络脉之瘀，从而发挥治疗PSO作用。

研究表明，五谷虫在慢性创面治疗中具有较高的价值，在清创的同时还具有调节免疫、抑制补体活化、抗炎等作用［10］。五谷虫提取物通过抑制核因子-κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的激活，进而抑制辅助性T细胞1（Th1）、辅助性T细胞17（Th17）及干扰素-γ（IFN-γ）、IL-17A等炎性因子的表达，从而显著缓解特应性皮炎模型小鼠的皮肤炎症，提示五谷虫具有抗炎、免疫调节等作用［13］。五谷虫可通过升高环腺苷酸抑制人单核细胞的促炎症反应，也可以抑制多种中性粒细胞促炎症反应［14］。五谷虫分泌物可抑制促炎介质和补体系统组分的产生和表达，并可抑制嗜中性粒细胞向创面区域迁移。研究结果证实五谷虫分泌物主要是通过抑制创面炎症反应，抑制组织分解从而共同达到促进创面愈合的效果［15］。

PSO皮疹好发于头皮、背部和四肢伸侧，典型表现为界限清楚的暗红色斑块或浸润性红斑，上附白色、银白色鳞屑［2］。采用改良的MPASI法评估PSO小鼠皮损严重程度。研究表明，给予IMQ连续诱导8 d，造模完成时小鼠表现出典型的PSO皮损特征，MPASI评分较正常组显著升高［16］。本研究结果显示，连续8 d 给予IMQ后，小鼠造模区域皮肤红斑、浸润、鳞屑等皮损症状显著增多，MPASI评分显著升高，提示IMQ成功诱导出小鼠严重PSO样皮损症状；给予五谷虫治疗后，小鼠造模区域皮肤红斑、浸润、鳞屑、皮损面积等皮损症状明显减少，MPASI 评分显著降低，且存在剂量-效应依赖关系，并不劣于本维莫德，提示五谷虫具有一定治疗皮肤损伤效果，可能与其具有促创面愈合及组织重建和再生功效有关。

IMQ诱导的PSO小鼠模型可模拟与人类相似的PSO病程及组织病理学症状，如表皮增生、角化不全、棘层肥大、组织增厚等［17］。故本研究采用IMQ诱导小鼠PSO模型。本研究显示，给予IMQ后，PSO小鼠造模区域皮肤出现角质层过度角化、角化不全，颗粒层变薄或消失，表皮层棘层肥厚，表皮突延长、起伏，真皮层单核及多核细胞浸润，乳突上顶等病理变化，耳廓肿胀厚度显著增加，这与Zheng 等［8］采用IMQ诱导小鼠PSO模型病理结果一致，提示IMQ成功诱导出小鼠PSO模型；给予五谷虫治疗后，PSO小鼠造模区域皮肤病理变化均得到有效改善、耳廓肿胀厚度显著降低，且存在剂量-效应依赖关系，并不劣于本维莫德，提示五谷虫具有一定改善PSO组织病理变化效果，可能与其抗炎功效有关。

临床研究表明64%～97%的PSO患者主诉瘙痒，且呈周期性、泛发性的特点［18］。给予IMQ诱导小鼠PSO模型，记录小鼠10 min内的抓挠次数，发现模型组小鼠抓挠次数较正常组显著增多；给予药物治疗后，给药组小鼠抓挠次数较模型组显著减少，瘙痒症状缓解［19］。本研究显示，给予IMQ后，PSO小鼠抓挠、撕咬、舔舐造模区域皮肤等行为明显活跃且抓挠次数显著增加，提示IMQ诱导可导致小鼠皮肤瘙痒；给予五谷虫治疗后，PSO小鼠抓挠、撕咬、舔舐造模区域皮肤等行为明显减少，抓挠次数显著减少，且存在剂量-效应依赖关系，并不劣于本维莫德，提示五谷虫具有一定止痒效果，可能与其具有清热功效有关。

脾脏可产生多种免疫活性细胞因子，脾脏指数的升高，说明机体炎症免疫反应激活了脾脏细胞增殖，在某种水平上反应机体的免疫功能异常［20］。IMQ诱导的PSO小鼠脾脏明显肿大，脾脏指数显著升高；给予药物治疗后，给药组小鼠脾脏指数显著降低［21］。本研究显示，给予IMQ后，PSO小鼠脾脏明显肿大，脾脏指数显著升高，提示IMQ诱导了PSO中免疫功能异常症状，可以使免疫系统亢进；给予五谷虫治疗后，PSO小鼠脾脏体积明显缩小，脾脏指数显著降低，且存在剂量-效应依赖关系，并不劣于本维莫德，提示五谷虫具有一定抑制免疫系统亢进效果，可能与其具有免疫调节功效有关。

肥大细胞是天然免疫细胞［22］，作为PSO皮损中最先出现的细胞，疾病初期时大量堆积于毛细血管周围，当被激活后可诱导产生PSO皮损。给予IMQ诱导小鼠PSO模型，模型组小鼠皮肤组织水肿情况严重，肥大细胞数激增；给予药物治疗后，给药组小鼠水肿情况较模型组有不同程度减轻，肥大细胞数减少明显，浸润情况改善［23］。本研究给予IMQ后，PSO小鼠背部皮肤中肥大细胞数量显著增多，提示IMQ诱导PSO中肥大细胞过度激活；给予五谷虫治疗后，肥大细胞浸润情况显著改善，数量显著减少，且存在剂量-效应依赖关系，并不劣于本维莫德，提示五谷虫可能通过抑制肥大细胞激活而对PSO发挥治疗效果。

IgG、IgM主要分布于血清中，具有激活补体、免疫调节等功能。通常情况下IgM产生早，一经机体免疫应答，快速产生，维持时间短，消失快，血液中检测阳性可作为早期免疫应答的指标。IgG是再次免疫应答的产物，出现时间较晚，维持时间长，消失慢［24］。IgG、IgM均可激活补体系统的经典途径［25］。PSO患者血清IgG的水平值比正常人群要高；而IgM的水平值报告不尽一致，可能与受试人群及PSO发病进程有关［24］。本研究显示，给予IMQ后，PSO小鼠血清IgG水平显著升高，IgM水平有增加趋势，但无显著性差异，可能由于IgM是早期免疫应答过程中产生的抗体，随着疾病进展，因消耗增多而逐步下降，IgG的升高可以反应炎症反应一直存在，免疫反应持续激活，提示IMQ通过升高IgG水平诱导了PSO中免疫应激症状；给予五谷虫治疗后，PSO小鼠血清IgG水平显著降低，提示五谷虫具有一定抑制免疫应激作用。

补体是皮肤免疫系统中体液成分的重要物质，被激活后可产生一系列复杂的生物学效应，参与多种皮肤病的发生发展。CH50 反映补体固有成分C1～C9 的综合水平，临床上主要用于评估机体免疫功能。补体活化、被大量消耗会导致补体成分减少，引起CH50 降低，可用于评估补体系统是否被激活［26］。C3、C5是补体活化过程中发挥生物学功能重要的补体成分，且C3在补体中含量最多。当机体补体系统发生异常或过度激活后，C3、C5裂解产生大量过敏毒素C3a、C5a促进PSO的发生发展。补体裂解产物C3a、C5a的产生情况可以反映补体的活化程度［27］。补体活化引起大量C3裂解为C3a，C5裂解为C5a，C3、C5含量下降，导致CH50含量下降，补体活化产物C3a、C5a含量升高［28］。本研究显示，给予IMQ后，模型组小鼠血清补体活化相关因子CH50、C3、C5水平显著降低，C1s、C3a、C5a水平显著升高；组织补体活化相关因子C1s、C3、C3a、C5、C5a 水平显著升高。这提示IMQ使大量C3裂解为C3a，C5裂解为C5a诱导了PSO中补体活化症状，对于PSO患者组织C3 升高，有研究［29］用直接免疫荧光（DIF）法证实PSO患者皮损中有免疫沉积物，在皮肤角质层内存在抗原-抗体-补体反应，推测PSO患者组织C3升高可能是因为血清C3沉积皮损处造成的。对于PSO患者组织C5升高，C5也可沉积于皮损处［30］。综上所述，PSO患者组织C3、C5升高可能是由于血清C3、C5沉积皮损处造成的。本研究给予五谷虫治疗后，PSO小鼠血清CH50、C3、C5水平显著升高，血清C1s、C3a、C5a 水平显著降低；组织C1s、C3、C3a、C5、C5a水平显著降低，提示五谷虫具有一定抑制补体活化效果。

部分适应性免疫系统的过度激活被认为是PSO发病的核心［31］。C3a和C5a可通过与其受体结合，诱导多种细胞分泌IL-23、IL-17A、TNF-α等炎性因子参与炎症调节，影响PSO的发生发展。给予IMQ诱导，PSO小鼠血清IL-23、IL-17A、TNF-α水平显著升高；给予药物治疗后，给药组小鼠血清IL-23、IL-17A、TNF-α水平显著降低，机体炎症反应程度显著减轻［32］。本研究显示，给予IMQ 后，PSO 小鼠血清IL-23、IL-17A、TNF-α水平显著升高，表明血清炎性因子处于激活状态，提示机体炎症反应程度较重；给予五谷虫治疗后，血清IL-23、IL-17A、TNF-α水平显著降低，提示五谷虫具有一定抗炎效果。

综上所述，本文研究了五谷虫对IMQ诱导的PSO小鼠的药效学及作用机制。五谷虫抑制IMQ诱导机体过度免疫反应引发的高IgG水平，进而抑制IgG激活补体系统经典途径，从而抑制大量C3、C5 裂解产生过敏毒素C3a、C5a 与其受体结合促进炎症反应，降低促炎因子IL-23、IL-17A、TNF-α的释放，降低PSO 小鼠体内免疫应激、补体活化及炎症反应水平，最终发挥PSO治疗作用。本研究初步阐明了五谷虫调控免疫应激-补体活化途径治疗PSO 的药效学及作用机制，为临床使用五谷虫治疗PSO提供理论依据和实验支撑。