Box-Behnken响应面法优化杠板归总酚酸的提取工艺

【摘 要】 目的：采用Box-Behnken-响应面法优化杠板归总酚酸的提取工艺。方法：以液料比、乙醇浓度和提取时间为考察因素，以总酚酸含量为评价指标，设计Box-Behnken实验进行工艺优化确定杠板归总酚酸的最佳提取工艺。结果：杠板归总酚酸最佳提取工艺为料液比31、乙醇浓度63%、超声时间46 min，此条件下总酚酸含量3.69 mg/g。结论：本试验优化所得的提取工艺高效稳定、操作简易，可用于杠板归中总酚酸的提取。

【关键词】 Box-Behnken响应面；杠板归；总酚酸；工艺优化

【中图分类号】R284.2

【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2024）19-0036-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.19.zgmzmjyyzz202419008

Optimization of Total Phenolic Acid in polygonum perfoliatum L. by Box-Behnken Response Surface Methodology

HU Xiaoli1 HUANG Ping2 ZHENG Kun^1*

1.Rizhao Hospital of Traditional Chinese Medicine， Rizhao 276800， China；

2. Department of Pharmacy Hangzhou Traditional Hospital of Chinese Medicine， Hangzhou 310007， China

Abstract：Objective To optimize the extraction process of total phenolic acids from Polygonum Perfoliatum L. by Box Behnken response surface methodology. Methods The method used liquid-solid ratio， ethanol concentration and extraction time as factors experiment. The total phenolic acid content was used as an evaluation index， and a Box Behnken experiment was designed to optimize the process to determine the optimal extraction process for total phenolic acid in the Polygonum Perfoliatum L.. Results The optimal extraction process for total phenolic acids was as follows： liquid ratio of 31， ethanol concentration of 63%， and extraction time of 46 minutes， the total phenolic acid content is 3.69 mg/g. Conclusion The process optimization method established in this experiment is efficient， stable， accurate， and reliable， and can be used for the extraction of total phenolic acid in polygonum perfoliatum L..

Key words：Box-Behnken Response Surface; Polygonum Perfoliatum L.; Total Phenolic acids; Process Optimization

杠板归又名蛇倒退、河白草、贯叶蓼等，系蓼科蓼属草本植物杠板归Polygonum perfoliatum L.的干燥地上部分，始载于《履巉岩本草》^［1］，现被《中国药典》^［2］（2020年版）收录，具有清热解毒、祛痰止咳、利水消肿、散瘀止血的功效，可用于咽喉肿痛、肺热咳嗽、湿热泻痢、蛇虫咬伤等^［3］，是一味历史悠久、药效确切和资源丰富的常用传统中药，极具应用前景和开发价值。研究^［4］显示，杠板归主要含有黄酮、酚酸、生物碱、挥发油等多类化学成分，其中酚酸类成分药理作用广泛，对心血管系统、肝脏、神经系统、肿瘤等疾病具有显著作用，且毒性小、化学结构简单，是很多中药或中成药质量控制的指标性成分^［5］，也已被广泛应用到食品、药品和化妆品中^［6］。

响应面法是一种较为新型、可确定多因素系统的试验方法，其主要原理是采用多元二次回归方程拟合试验因素与响应值之间的函数关系，并通过对回归方程的分析寻求最优工艺参数^［7］。目前对于杠板归有效成分的提取工艺优化研究，主要集中于黄酮类成分^［8-9］，还未见酚酸类成分提取工艺优化相关研究报道。因此，本研究以总酚酸为研究对象，采用Box-Behnken响应面法优化杠板归中总酚酸的提取工艺，以期为杠板归的有效成分提取、资源开发利用等提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 UV-752PC紫外可见分光光度计（望皖科技有限公司）；FA2104N电子天平（上海仪天仪器有限公司）；KQ-500DE型超声提取仪（昆山超声仪器公司）。

1.2 试药 没食子酸对照品（批号：110831-202008，质量分数98.6%）购自中国食品药品检定研究院；乙腈、磷酸为色谱纯，购自赛默飞世尔公司；杠板归及其根茎叶购自溪岸大药房（批号分别为210315），经本院郑昆主任药师鉴定为蓼科蓼属草本植物杠板归Polygonum perfoliatum L.。

2 方法与结果

2.1 标准品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的没食子酸对照品10.82 mg，置25 mL的容量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，得质量浓度为420.0 μg/mL的标准品溶液。

2.2 供试品溶液的制备 精密称取杠板归药材1.0 g，置50 mL锥形瓶中，加入相应的提取溶液，称重，超声提取适宜时间，冷却，再称定重量，用提取溶液补足减失重量，过滤，得供试品溶液。

2.3 总酚酸的含量测定 取“2.2”项下的供试品溶液1.0 mL，置于25 mL棕色容量瓶中棕色容量瓶中，加入蒸馏水5 mL、福林酚试剂1.2 mL，摇匀避光反应1 min，再加入 10% Na2CO3溶液4 mL，用蒸馏水定容至刻度，40℃恒温下避光反应90 min，于750 nm波长处测定吸光度^［10］。计算杠板归中总酚酸含量，总酚酸含量=（A+0.0023）×V×25/（0.0748×m）。式中A为吸光度；V为提取液体积；m为样品取样量。

2.4 方法学的考察

2.4.1 标准曲线的绘制 精密移取“2.1”项下对照品溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL，分别置于25 mL的棕色容量瓶中，加入蒸馏水5 mL、福林酚试剂1.2 mL，摇匀避光反应1 min，再加入10% Na2CO3溶液4 mL，用蒸馏水定容至刻度，40℃恒温下避光反应90 min，以蒸馏水为参比溶液，于750 nm波长处测定不同浓度下的吸光度。以吸光度A为纵坐标，对照品浓度为X横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=0.0748X-0.0023（r=0.9998），表明没食子酸对照品溶液在1.68 ～ 10.08 μg/mL范围内与吸光度线性关系良好。

nE+EF8cztU8xsKH5JHPxkbUdZikPo7gLMojf6oJR2tE=

2.4.2 精密度试验 取“2.1”项下对照品溶液，按照“2.3”项下方法连续进样测定6次吸光度。结果吸光度的RSD为0.97%，表明仪器的精密度良好。

2.4.3 重复性试验 取杠板归药材，按“2.2”项下供试品制备方法制备6份供试品溶液，按照“2.3”项下方法操作测定吸光并计算总酚酸的含量。结果总酚酸平均含量为3.58 mg/g，RSD为1.69%，表明方法的重复性较好。

2.4.4 稳定性试验 取供试品溶液，分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h下测定吸光度并计算RSD，结果吸光度的RSD为1.53%，表明溶液在12 h内稳定。

2.4.5 加样回收率试验 取杠板归药材0.5 g，平行6份，按优化所得的提取方法（料液比31、乙醇浓度63%、超声时间46 min）制备供试品溶液，加入等量的没食子酸对照品，按照“2.3”项下方法测定吸光度，计算总酚酸含量及回收率。结果见表1。

2.5 响应面法试验设计与实验结果 以乙醇浓度、提取时间、液料比3个因素为设计因素，以总酚酸含量为响应值，设计3因素3水平的试验方案，根据 Box-Behnken中心组合的设计，经过Design-Expert V8.0.6 软件的处理，设计3因素3水平的17组试验，每组平行3份，具体的试验方案及所得结果见表2。

2.6 方差分析 应用Design-Expert.V8.0.6软件对优化的实验数据进行分析，杠板归总酚酸含量对液料比、乙醇浓度、提取时间的回归方程为：Y=3.73+0.06A+0.19B+0.18C+0.03AB-0.06AC-0.02BC-0.26A2-0.30B2-0.89C2。方差分析结果见表3。由表3可知，提取工艺的回归模型 F＝30.33，P<0.0001，显示出极显著水平，失拟项P值为0.3486>0.05，呈现不显著，表明所建立的模型拟合良好，回归可靠，可用于杠板归总酚酸的提取工艺分析。

2.7 响应面分析 采用Design-Expert 8.0.6软件绘制杠板归总酚酸含量与液料比、乙醇浓度和提取时间之间的等高线图，结果如图1所示。根据响应曲面优化原理可知，3D曲面图的坡度越大，说明操作条件对结果的影响就越大；曲面图坡度越小，则对结果的影响就越小。本试验的研究结果显示，杠板归中总酚酸的最佳提取工艺参数为：料液比31.22、乙醇浓度63.27%、超声时间46.39 min，总酚酸含量的预测值为3.77 mg/g。

2.8 优化结果的试验验证 根据上述优化所得的工艺，平行制备3份杠板归供试品溶液进行验证。为便于操作，将条件修正为料液比31、乙醇浓度63%、超声时间46 min，此条件下得到总酚酸含量3.69 mg/g，与预测值接近，RSD为1.52%，表明模型预测性良好，工艺稳定可靠。

3 讨论

3.1 考察因素的选择 研究显示，总酚酸的提取与液料比、提取溶剂、提取时间、提取温度等因素有关。本试验对液料比、提取溶剂、提取时间、提取温度4个因素进行了考察。结果显示，液料比、提取溶剂、提取时间对杠板归总酚酸的提取影响较大，提取温度无显著影响。因此，本试验最终选择液料比、提取溶剂、提取时间3个因素进行优化。

3.2 优化方法的选择 适宜的提取方法可充分的提取中药药效物质，能更好地利用中药有效成分。目前，对于中药有效成分提取方法的优化主要是正交法和响应面法。传统的正交设计方法是通过线性数学模型进行设计的方法，可找出多个因素水平的最佳组合，但只能分析离散型数据，精度不高，预测性不佳。而响应面法则是采用非线性模型，可以求得高精度的回归方程，进行合理预测来找出最优工艺条件，已被广泛用于中药成分提取或者炮制工艺的优化^［11］。因此，本试验选择响应面法优选杠板归中总酚酸的提取工艺。

酚酸类成分具有抗氧化、抗病毒、抗炎抗菌、肝脏保护等广泛的药理作用^［12］，在杠板归中含量较高，也是杠板归主要药效成分。本试验对其总酚酸的提取工艺进行优化，得到最佳提取工艺为：料液比31、乙醇浓度63%、超声时间46 min，此条件下得到总酚酸含量3.69 mg/g，验证实验结果也表明所优化的提取工艺高效稳定、操作简易，可为杠板归有效成分的提取提供参考依据。0205c45d58105bdbed7e655d0e946bde

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（收稿日期：2024-01-08 编辑：陶希睿）