【摘 要】 目的:探讨瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠Th17/Treg免疫平衡的影响。方法:将40只健康SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、神火灸组及艾灸组4组,使用线栓术制作缺血再灌注模型,在治疗前、治疗14 d后对大鼠神经功能缺损进行评分,使用TTC染色观察不同治疗组脑梗死体积变化,使用RT-PCR法检测各组大鼠脑组织中IL-17 mRNA、IL-6 mRNA、TGF-β2mRNA、IL-10 mRNA的表达水平,并比较Th17/Treg轴比值变化情况。结果:经治疗,神火灸组及艾灸组脑梗死体积与模型组相比减小(P<0.05),同时神火灸组脑梗死体积比艾灸组更小(P<0.05);神火灸组及艾灸组神经功能均改善,其中神火灸组神经功能改善更显著;与模型组及艾灸组相比,瑶医神火灸组IL-17 mRNA、IL-6 mRNA等的表达减少(P<0.05),而TGF-β2 mRNA、IL-10 mRNA水平的表达增加(P<0.05),经过两者比较发现神火灸组IL-6/IL-10比值降低,差异具有统计学意义(P<0.05),提示经过瑶医神火灸干预后Th17/Treg免疫平衡下降,具有统计学意义。结论:瑶医神火灸可以通过降低Th17分泌的促炎因子及升高Treg分泌的抗炎因子的水平,从而调节Th17/Treg免疫平衡轴,减轻脑缺血再灌注损伤。
【关键词】 瑶医神火灸;Th17/Treg;免疫炎症
【中图分类号】R29
【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517(2024)19-0022-07
DOI:10.3969/j.issn.1007-8517.2024.19.zgmzmjyyzz202419006
Study on the Effect of Yao Medicine Shenhuo Moxibustion on Improving Ischemia-reperfusion Rat Model
by Regulating the Imbalance of Immune Function of Th17/Treg Axis
LIN Xiumiao1,2 LIAO Zhongling1,2 YU Peishan1,2 ZHOU Zheyi1*
1. Liuzhou Traditional Chinese Medical Hospital, Liuzhou 545000, China;
2. Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530000, China
Abstract:Objective To investigate the effect of Shenhuo moxibustion of yao medicine ischemia-reperfusion in rats of Th17/Treg immune balance.Methods Forty healthy male SD rats were randomly divided into 4 groups: sham operation group, model group, shenhuo moxibustion group and moxibustion group.Thread block method was used to establish the cerebral ischemia reperfusion injury model in rats.After the reperfusion for 14 days,efforts were made to give neurological score;The expression levels of IL-17 mRNA, IL-6 mRNA, TGF-β2 mRNA and IL-10 mRNA in the brain tissues of rats in each group were detected by RT-PCR, and the changes of Th17/Treg axis ratio were compared.Results After treatment, the nerve function of Shenhuo moxibustion group and moxibustion group were improved, and the nerve function of Shenhuo moxibustion group was improved more significantly;IL-17 mRNA,IL-6 mRNA,TGF-β2mRNA and IL-10 mRNA were detected by RT-PCR. Compared with the model group and moxibustion group, the expressions of IL-17 mRNA and IL-6 mRNA in yaoyishen moxibustion group were decreased (P<0.05).After comparison between the two groups, it was found that the IL-6/IL-10 ratio of shenhuo moxibustion group decreased, and the difference was statistically significant (P<0.05), suggesting that the Immune balance of Th17/Treg decreased after yao Medico moxibustion intervention, which was statistically significant.Conclusion shenhuo moxibustion may reduce the pro-inflammatory factors secreted by Th17 and increase the expression of anti-inflammatory factors secreted by Treg, and regulate the immune balance axis of Th17/Treg.
Key words:Shenhuo Moxibustion of Yao Medicine;Th17/Treg;Immune Inflammation
脑血管病是一类具有“高发病率、高致残率及高死亡率”的疾病,其分为脑梗死及脑出血。脑梗死是由脑血液循环异常而突然发作的一类病症,脑缺血后经过治疗后侧支循环随之建立再灌注供血,但缺血后再灌注时可能造成再灌注损伤,被称为缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion I/R)[1],这一过程病理机制复杂,涉及免疫炎症反应、氧化应激、钙超载、自噬和兴奋性氨基酸毒性等[2]。越来越多的研究[3]发现,脑梗死的发生及进展与免疫炎症反应关系密切,在发生脑梗死后,大量的T细胞侵入大脑,并在梗死区周围汇聚、激活,致使免疫炎症反应加重,进而加重脑组织损害,因此抑制免疫炎症反应可有效地减轻脑卒中后的损伤。Th17在免疫反应中起到破坏作用,发生疾病时可能变成极强的致炎细胞。Treg细胞与Th17细胞作用几乎是反向的,Treg细胞具有保护作用,活化的Treg细胞可以减轻自身免疫炎症反应[4]。近年研究[5]发现Th17/Treg免疫平衡轴失衡可能影响缺血性脑卒中的缺血再灌注损伤,调节Th17/Treg免疫平衡轴向Treg偏移,对调控自身免疫炎症反应及促进脑梗死的预后有重要作用。中医治疗疾病已具几千年历史,并且认为对治疗脑梗死具有较好的疗效,中医针对疾病的治疗具有多靶点、多方面综合作用。广西作为瑶医的发源地,外治手段丰富,瑶医神火灸属于瑶医外治法之一,具有活血化瘀、疏通经络等作用,前期研究[6]表明,瑶医神火灸对治疗卒中后抑郁及肩手综合征具有较好的疗效。为探讨瑶医神火灸通过调控Th17/Treg轴免疫功能失衡改善缺血再灌注损伤大鼠,本研究主要通过建立MCAO(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型,检测Th17及Treg相关炎症因子变化水平,为治疗缺血性脑梗死寻求新的、更可靠的治疗策略。
1 材料和方法
1.1 实验动物及分组 在饲养6~8周大鼠中选取40只健康SD雄性大鼠,体重240~300 g,所有大鼠由长沙市天勤生物技术有限公司购买,实验动物可证为SYXK桂2010-0001。大鼠饲养均由我院神经内科实验员饲养,每只笼子放大鼠5只分开饲养,24 h提供水及食物,限制适宜温度为(22±2) ℃,全天空调开放,12 h黑暗及12 h光照交替,定期更换鼠料垫片,保证大鼠在适宜的环境中生长。
1.2 实验药材 选用艾条:用直径0.3 cm,长10 cm的艾条(烟台爱心药业有限公司,国药准字Z37021259);瑶医神火棍棒:由我院制备(专利号:ZL2013.1.0729550.2)。
1.3 仪器 详见表1。
1.4 试剂 详见表2。
1.5 主要溶液配制 10%水合氯醛麻醉溶液:按照1∶[KG-*3/5]10的比例对水合氯醛和灭菌水进行配制,现配现用,避免久留影响麻醉效果。
1.6 分组方法实验动物 将40只健康SD雄性大鼠按照随机数字法分为数量相等的假手术组、模型组、艾灸组及神火灸组等4 组,每组各10只。
1.7 模型建立 MCAO模型的制作参照Zea-Longa经典造模方法[7]进行制作。大鼠使用10%水合氯醛(350 mg/kg)经腹腔进行麻醉,利用痛刺激检查麻醉深度,将麻醉完成的大鼠进行分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)及伴行的神经,使用线栓把大脑中动脉的血流阻断,至缺血2 h后拔出线栓再灌注24 h。假手术组的大鼠模型建立与MCAO模型相似,但仅分离CCA,不置入线栓。
1.8 神经功能缺损评定 在造模成功后参照Longa神经功能缺损评分稍改良后对大鼠进行评定,将造膜后的大鼠评分分为六个等级,具体为:0分为没有神经功能受损的表现;1分为当轻拉尾部时,左侧前爪握力稍减弱;2分为向左侧转圈,但可在地面上自由行走;3分为刺激方可行走;4分为不能行走,对刺激无反应,甚至意识消失;5分为死亡,并且将评分为0分、5分的大鼠排除出组,再随机补充大鼠,即入选标准为1~4分。
1.9 TTC染色 从每组当中随机取3只大鼠,使用3%水合氯醛麻醉大鼠后断头取脑,去掉小脑与脑干,仅保留大脑组织。将脑组织放入-20 ℃冰箱冷冻20 min后取出,用刀片沿冠状面切成5片厚度为2~3 mm的脑组织切片。再将切好的脑组织切片放于小皿中,加入0.5%TTC染液使切片充分浸泡,完成后37 ℃避光水浴加热20 min。染色完成后取出切片,按脑组织位置顺序依次竖向排列,观察脑组织梗死情况,并拍照保存。使用Image J软件分析梗死面积,并计算出梗死体积占比。梗死体积占比=(∑梗死面积×脑片厚度)/(∑全脑总面积×脑片厚度)
1.10 瑶医神火灸制备 药枝制备由本课题组自行制备(制备方法已申请相关发明专利:专利号 ZL2013.1.0729550.2),来源稳定,制备方法成熟(详见专利):选取追骨风、牛耳风、大钻、当归藤、四方藤等地道原生新鲜药材粗大茎枝(直径 1~2 cm),切成 15~20 cm,阴干后配生姜、地龙、全蝎加入40~50度白酒中浸泡,用白酒浸泡约半个月,取出阴干后即为备用药枝。
以上药物均为“风药”,但不同药物性味及功效不同。追骨风又称王不留行,味甘,性平,具有活血化瘀、通经止痛、清热解毒等功效;牛耳风又称黑风藤,味甘,性温,具有活血化瘀、通经止痛、强筋健骨等功效;大钻味辛,性温,具有活血化瘀、行气止痛等功效;当归藤味苦,性温,具有补血活血、强筋健骨等功效;四方藤味甘,性平,具有祛瘀生新、舒筋活络等功效;但其共性均具有活血化瘀的功效。
其他材料:酒精灯、双层牛皮纸、打火机或火柴、小瓶子(瓶口大小略大于药枝直径)等[8]。
1.11 瑶医神火灸及艾灸处理 在MCAO制作成功后,分别对艾灸组及神火灸组给予艾灸及瑶医神火灸干预,选取穴位为百会、双侧足三里、双侧曲池,穴位位置参考《实验针灸学》[9]。
本课题小组选择6人进行严格培训后对大鼠进行施灸,6人分3小组,每组2人,一人固定大鼠,一人对大鼠进行施灸;每天分别对选取的穴位进行施灸,施灸时间为白天,不分上下午;施灸过程中先固定大鼠后进行施灸,传统艾灸组是将艾条对准穴位进行施灸,艾灸距离选取穴位约为2~3 cm,每个穴位连续施灸3~5 min,每天1次,连续干预14 d;神火灸组则是将制备好的药枝用明火将其点燃,用牛皮纸包裹后随即按在施灸穴位上进行施灸,干预方法与传统艾灸组一致,每个穴位3~5 min,每天1次,连续14 d;模型组及假手术组不治疗,予平行捆绑。
1.12 瑶医神火灸、艾灸施灸注意事项及不良事件处理 施灸注意事项及处理:①施灸前要确保周围环境安全,避免发生火灾,在实验室旁边放置灭火器备用;②施灸前确保药枝是熄灭状态,牛皮纸包裹好后再施灸,避免烫伤大鼠皮肤及烧灼毛发。
1.13 大鼠脑组织 取材再灌注14 d后,将大鼠处死提取脑组织,放入1.5 mLEP管中,置于-80 ℃超低温箱中冷藏,等待RT-qPCR检测相关炎症因子mRNA的表达量。
1.14 RT-qPCR检测 大鼠脑组织IL-17、IL-6、IL-10、TGF-β2mRNA的表达将上述提取的脑组织提取总RNA,利用超微量紫外分析仪进行RNA浓度及纯度检测OD值,将提取的RNA进行逆转录,配置IL-17、IL-6、IL-10、TGF-β2各因子相关引物进行扩增,按照2-△△CT相对定量法计算各基因相对表达量。
1.15 统计学分析 数据均使用SPSS 26.0统计软件处理,计量资料结果用(x±s)表示,组内治疗前与治疗后比较用配对t检验或者配对秩和检验,符合正态分布时选用前者,不符合选用后者;组间比较当符合正态分布且方差齐时采用方差分析进行,不符合正态分布时采用多样本秩和检验,以P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠再灌注神经功能缺损评分 四组大鼠神经功能缺损评分提示治疗前假手术组大鼠分数为0分,即未发现神经功能缺损症状,模型组、艾灸组及神火灸组大鼠在造模成功后出现了不同程度的神经功能受损。治疗后神火灸干预组大鼠神经缺损评分显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。具体见表3。
2.2 TTC染色脑梗死情况 与假手术组相比,模型组脑组织梗死体积比更高,差异具有统计学意义(P<0.05);与模型组相对比,经艾灸干预的艾灸组脑梗死体积比减少,差异具有统计学意义(P<0.05);与艾灸组比较,神火灸组脑梗死体积比显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。具体如图1。
2.3 瑶医神火灸对 MCAO大鼠脑组织Th17分泌相关细胞因子IL-17、IL-6及Treg分泌相关因子IL-10、TGF-β2mRNA表达水平的影响 与假手术组相比,模型组脑组织中Th17细胞分泌的促炎细胞因子IL-6、IL-17mRNA表达水平上升,而Treg细胞分泌的抗炎因子IL-10、TGF-β2mRNA表达水平降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与模型组相对比,经艾灸干预的艾灸组Th17细胞分泌的促炎细胞因子IL-6、IL-17mRNA表达水平降低,而Treg细胞分泌的抗炎因子IL-10、TGF-β2 mRNA表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与艾灸组比较,神火灸组Th17细胞分泌的IL-6、IL-17mRNA表达水平显著下降,而Treg细胞分泌的抗炎因子IL-10、TGF-β2 mRNA表达水平显著上升,差异具有统计学意义(P<0.05)。具体见表4、表5,如图2、图3。
2.4 各组大鼠IL-6/IL-10mRNA相对表达量的比值变化 结果显示,经过14 d干预后,与模型组对比,艾灸组及神火灸组IL-6与IL-10mRNA相对表达量的比值均下降,差异具有统计学意义(P<0.05);与艾灸组对比,神火灸组下降更显著,差异具有统计学意义(P<0.05)。具体见表6。
3 讨论
缺血性脑卒中是由血管闭塞或狭窄引起的,占所有卒中的85%[10]。缺血性脑卒中发生后可引起缺血再灌注损伤,使脑组织损伤加重,可进一步加重梗死区域[11]。随着医疗的进步,目前治疗脑卒中的方法逐渐增多,如静脉溶栓、血管内取栓和药物治疗等,但仍有大部分患者预后欠佳,并在获救治的时候出现再灌注损伤[12-13]。Treg细胞和Th17细胞是CD4+T细胞分化的两个亚群,在免疫稳态和感染中发挥重要作用,Th17/Treg细胞平衡失衡被证明与多种疾病的发生和进展关系密切[14]。免疫炎症反应可参与到缺血性脑卒中的病理生理过程,IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β等炎症因子被认为是缺血再灌注损伤重要的炎症因子[15]。IL-6、IL-17是Th17细胞关键的炎症因子之一,可由星形胶质细胞、小胶质细胞、白细胞和内皮细胞等不同的细胞释放,在发生脑卒中后可参与至脑损伤反应,在缺血区、大脑皮层和海马区表达,缺血外周区表达最明显[16]。张亚敏等[17]在大鼠缺血再灌注的早期利用针灸进行治疗大鼠,发现经过针刺后,大鼠的炎症反应得到抑制,脑组织神经得以修复,主要是针刺可降低IL-6的表达水平而实现,该实验有效抑制免疫炎症反应,对脑神经元起到保护作用。IL-17即使没有直接表现出神经性的毒副作用,但它通过激活内皮细胞促进炎症的发生、血脑屏障的破坏以及中性粒细胞聚集,加重缺血性脑卒中的损伤[18]。TGF-β2及IL-10均为Treg分泌的抗炎因子,在血管生成、神经保护、神经免疫功能、神经再生和突触可塑性等方面发挥着至关重要的作用,属于神经系统中不可或缺的因子,通过降低细胞因子表达和抑制受体的受体激活来抑制炎症反应,减少内皮细胞损伤,改善血管功能障碍[19-20]。动物模型的研究[21]中,动脉粥样硬化斑块炎症反应的敏感指标包括Th17/Treg比值,它的失衡可能在动脉粥样硬化斑块炎症反应中发挥重要作用。LIU等[22]通过研究发现Th17/Treg比值的改变,使Th17减少而同时增加Treg进而减轻免疫炎症反应。近期其他研究[23]也发现,Th17/Treg免疫平衡与脑缺血再灌注损伤关系密切,在脑缺血后,其平衡轴可通过调节局部组织内促炎因子和抗炎因子水平而加重损伤程度,并影响预后恢复。综上,调节Th17/Treg免疫平衡轴可成为降低脑缺血再灌注损伤的重要举措。
西医学缺血性脑卒中的治疗方案存在部分副作用,且费用较高。随着中医体系的不断完善,中医药治疗疾病已有几千年的历史,中医治疗具有多靶点、多方位及副作用少等优点,因此,寻找有效中医疗法对减少缺血再灌注损伤具有重要意义。广西是瑶族聚集地,瑶医药治病具有独特优势。瑶医药治疗疾病主要遵循的理论依据为“盈亏平衡”理论,而盈亏平衡更注重的是人体内部自身的平衡。神火灸属瑶医外治法的一种,具有活血化瘀、通经活络等功效,通过适当的温热刺激穴位来激发筋脉的功能,起到调节机体器官组织功能以恢复人体盈亏平衡状态,以达治疗疾病的目的[24],但目前使用瑶医神火灸治疗疾病尚少,灸法本享有“药之不达,必以灸之”的称誉,而神火灸更是直接将热力传至机体,周哲屹[8]前期研究发现瑶医神火灸可能通过抑制免疫炎症反应对缺血再灌注损伤神经起到保护作用。
研究结果提示,模型组Th17分泌的促炎因子IL-6 mRNA、IL-17 mRNA与假手术组对比均升高,Treg分泌的抗炎因子IL-10 mRNA、TGF-β2 mRNA与假手术组对比均下降,其相应的比值也在下降,说明制作MCAO后大鼠脑组织发生炎症反应,存在Th17/Treg免疫失衡。在使用神火灸及艾灸干预14 d后,各组大鼠的神经功能功能评分均降低,但是神火灸组降低较艾灸组显著。虽然艾灸及神火灸均有下降,而神火灸组改善神经功能方面作用更显著,考虑可能因为神火灸组热力直接作用在相应穴位上,具有热效应和穴位刺激作用。在对于Th17/Treg免疫平衡方面,瑶医神火灸可以提高IL-10、TGF-β2mRNA抗炎因子的表达水平,并且降低Th17 细胞的分化,降低IL-6、IL-17mRNA促炎因子的表达水平。Th17/Treg比值发生变化,提示神火灸可以降低Th17分泌的促炎因子及升高Treg分泌的抗炎因子的表达,通过干预Th17/Treg相关炎症因子表达,调节Th17/Treg免疫平衡轴失衡起到改善缺血再灌注损伤大鼠神经功能缺损的作用。
综上所述,瑶医神火灸治疗可降低大鼠脑缺血再灌注损伤后血清中IL-6、IL-17水平,升高IL-10、TGF-β2水平,从而对脑缺血再灌注损伤过程中的炎症反应起到抑制作用,以上表明瑶医神火灸调节Th17/Treg平衡可能是缺血再灌注损伤的有效途径,本研究样本量较少,存在一定不足,其作用机制尚不能完全明确,后期将进行深入探索研究。
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(收稿日期:2024-01-02 编辑:刘 斌)
中国民族民间医药·上半月2024年10期