H47Q突变对促炎蛋白hGIIA结构稳定性的影响

摘要：为研究H47Q突变对促炎蛋白hGIIA结构稳定性的影响，分别对天然型和突变型（H47Q）的hGIIA进行多次重复模拟，然后对串联轨迹进行了几何性质比较、基本动力学分析并构建了自由能图谱。结果显示，与天然型hGIIA相比，突变型hGIIA拥有更多的原子间非键相互作用，更小的回旋半径，更低的整体构象柔性和全局自由能最小化区域。与天然型hGIIA相比，突变型hGIIA结构可能采取了更加紧凑包装，导致hGIIA整体构象柔性的下降，局限在更小的构象空间，不利于hGIIA与底物和整合素的结合。

关键词：IIA分泌型磷脂酶A2;hGIIA;分子动力学;本质动力学;自由能图谱hGIIA（human group IIA sPLA2，人类IIA分泌型磷脂酶A2）属于磷脂酶A2（secretory phospholipase A2，sPLA2）家族的酶，该酶由PLA2G2A基因编码。在细胞外液中，hGIIA通过水解甘油酯中sn2位酯键，促使白三烯（前列腺素的前体）、血小板激活因子等炎性介质的产生从而发挥促炎作用。hGIIA的促炎作用不仅与肺癌的形成与转移密切相关［1］，而且在类风湿关节炎［2］、动脉粥样硬化［3］中也异常表达或活性增强，因此hGIIA被认为是治疗炎症失控症状的潜在靶点。遗憾的是，针对hGIIA开发的选择性抑制剂varespladib和darapladib在Ⅲ期临床实验中均未达到预期效果，这表明把hGIIA作为炎症调节独立的药物靶点可能并不合理。hGIIA与细胞上的整合素αvβ3＼＼α4β1＼＼α5β1相互作用，同时诱发炎症反应和细胞增殖，这一事实就是一个很好的证明［4］。hGIIA第47位组氨酸突变为谷氨酰胺（H47Q突变），显著降低了hGIIA的活性，为hGIIA与整合素作用机制研究提供了新的切入点。

hGIIA全长包括124个氨基酸残基，相对分子质量约为1.4 kDa。hGIIA晶体结构由一个较小的C端和N端、6个α螺旋、2个β折叠、1个保守的Ca2+结合环和保守的催化二联体His/Asp（图1A）。其酶结构只有一个域，底物结合口袋入口主要由α1、α2、Ca2+结合环构成，α3、α4位于结合口袋的底部，与整合素的结合涉及5个肽段（图1B）。

1材料与方法

1.1模拟体系构建

从PDB数据库中获取完整的天然型hGIIA（NThGIIA）结构PDB ID：3U8D和H47Q突变型（MThGIIA）结构PDB ID：1N28。使用PyMOL分解晶体结构均以A链作为模板， MThGIIA使用PyMOL的PySwissSidechain插件进行了A1N突变建模，确保了天然型和突变型结构的可比性。

1.2分子动力学模拟（Molecular dynamics，MD）

分子动力学模拟使用GROMACS5.1.2和AMBER99SBLIDN全原子立场，水分子模型为TIP3P，体系溶剂化遵循边界原子向外延伸1.0 nm的原则，构建十二面体水盒子。使用最陡下降法对2个体系进行能量优化。然后对模拟体系进行NVT和NPT各10 ns平衡模拟，对每个模拟体系分别进行3个独立100 ns生产动力学模拟。

1.3分析方法

通过计算模拟过程中溶质结构相对于初始结构的骨架RMSD（Root Mean Square Deviation），评价了轨迹的平衡性，然后比较了2个模拟的几何性质。最后进行了本质动力学分析（Principal Component Analysis，PCA），并构建了蛋白质溶剂体系的自由能图谱（Free Energy Landscape，FEL）。

2结果

2.1轨迹平衡及收敛性

NThGIIA的3个模拟副本，大约5 ns可以达到相对稳定的RMSD值，而MThGIIA的3个副本仅需要3 ns便达到相对稳定的RMSD波动，表明MThGIIA比NThGIIA更容易达到平衡波动。对于每个系统，分别将3个轨迹中的平衡轨迹部分（5～100 ns）串联成一个285 ns的组合轨迹。

依据表1动态结构性质的定量分析可以得出：在模拟过程中，与NThGIIA 结构相比，MThGIIA结构模型更加紧凑。

a氢键的数量。如果供体氢受体原子的角度大于120°且供体与受体原子的距离小于3.5 ，则表明供体与受体之间存在氢键。

b溶剂可及表面积。

c范德华接触数量。如果2个原子之间的距离小于6 ，则表明这2个原子之间存在近距离接触。

d回旋半径。

e相应二级结构单元中的残基数量。

f使用Amber99sbildn力场以及PME静电处理方式计算的势能。

2.2构象柔性比较

除了数量有限的区域之外，NThGIIA在整体上比MThGIIA具有更高的柔性。在模拟过程中，除了Ca2+结合环，α1、α2、α3、α4都具有相对于其初始结构更低的构象偏差值，这正是底物结合口袋具有高构象柔性的原因。此外，在两个模型中， Res1115、Res3557、Res97112肽段均具有较低的RMSD值（lt;0.3 nm），表现出较高的刚性;而Res7174和Res118124肽段均具有较高的RMSD值，表现出较高的柔性。

2.3本质动力学分析

本质动力学分析表明，2个hGIIA的模拟轨迹均只有少数本征向量具有显著的本征值。对角线化处理NThGIIA和MThGIIA的Ca原子协方差矩阵后，得到总均方波动值分别为7.67 nm2和5.15 nm2，表明NThGIIA在模拟中经历了更大的构象波动。NThGIIA和MThGIIA的前10个和前30个本征向量的均方波动之和占总均方根波动的比例分别为87.4%、95.2%、85.2%和94.2%。

2.4自由能图谱分析

图2以前2个本征向量投射为坐标系，分别构建NThGIIA和MThGIIA的二维FEL。NThGIIA的FEL中PC1和PC2所跨越的范围分别为3.3 nm、5.6 nm，而MThGIIA的FEL中PC1和PC2所跨越的范围分别为2.8 nm、4.1 nm，表明前者较后者具有更大的自由能表面积。2个模型都有2个主要的自由能井， MThGIIA全局自由能最小化区域（-8.7 kcal/mol）比NThGIIA全局自由能最小化区域（-8.5 kcal/mol）更低，说明前者具有更高的热稳定性。

3讨论

（1） H47Q突变显著降低了hGIIA的活性，但是并不影响hGIIA与整合素的结合。这表明H47Q突变并不是影响hGIIA与整合素相互作用的关键因素，因此探究hGIIA的H47Q突变体结构稳定性有助于理解hGIIA与整合素的作用机制。

（2） NThGIIA具有更大的全局构象柔性和局部构象柔性，这意味着NThGIIA比MThGIIA具有更多的构象子状态、更丰富的构象多样性以及更加复杂的动力学行为。NThGIIA自由能表面更为粗糙、复杂。越粗糙的自由能表面所导致的多构象状态决定了hGIIA的功能多样性。MThGIIA比NThGIIA具有更多的范德华接触，这是导致其具有更低自由能的原因。

（3） MThGIIA底物结合口袋被限制在更少的构象空间，不利于蛋白与底物结合。根据诱导契合学，底物结合口袋构象变化受限导致底物结合能力下降，可能是导致MThGIIA失活的另一个重要原因［5］。hGIIA与整合素结合的Res1115、Res3553、Res97112的3个肽段均表现出较低的柔性，这些肽段可能是整合素能够有效识别hGIIA的关键位点。针对hGIIA底物结合口袋联合整合素结合位点的药物开发可能是一个更优的选择。

参考文献：

［1］DONG Z， MELLER J， SUCCOP P， et al. Secretory phospholipase A2IIa upregulates HER/HER2elicited signaling in lung cancer cells［J］. International Journal of Oncology， 2014， 45（3）： 978-984.

［2］BOILARD E， LAI Y， LARABEE K， et al. A novel antiinflammatory role for secretory phospholipase A2 in immune complexmediated arthritis［J］. EMBO Molecular Medicine， 2010， 2（5）： 172-187.

［3］ROSENSON R S， HURTCAMEJO E. Phospholipase A2 enzymes and the risk of atherosclerosis［J］. European Heart Journal， 2012， 33（23）： 2899-2909.

［4］FUJITA M， ZHU K， FUJITA C K， et al. Proinflammatory secreted phospholipase A2 type IIA （sPLAIIA） induces integrin activation through direct binding to a newly identified binding site （site 2） in integrins αvβ3， α4β1， and α5β1［J］. Journal of Biological Chemistry， 2015， 290（1）： 259-271.

［5］张珊，巩卫康，张娜，等.人分泌型磷脂酶A2ⅡA的功能性动力学特征研究［J］.生物化学与生物物理进展，2022（7）：49.

基金项目：2022年度云南省教育厅科学研究基金项目“H47Q突变对人类sPLA2IIA酶动力学的影响研究”（2022J1681）;2021年度昭通市“十四五”教育研究规划课题“昭通卫生职业教育实验教学效益研究”（202136）

作者简介：张忠弘，女，四川渠县人，副教授，本科，研究方向：分子生物学。

通信作者：李智，男，四川苍溪人，副教授，在职研究生，研究方向：分子生物学。