响应面优化低共熔溶剂提取香榧外壳总黄酮研究

香榧属红豆杉科榧属，为常绿乔木，其果实可以食用，而香榧壳一般作为废弃物处理，造成资源浪费。其实，香榧壳中含有总黄酮等活性物质，提取其中的活性物质，可以解决香榧壳的浪费问题。近年来，低共熔溶剂提取成为了研究热门，本研究分析了低共熔溶剂对香榧外壳总黄酮的提取效果，并优化了提取工艺，最后得到最佳的提取工艺，为香榧壳中总黄酮物质的提取提供了借鉴。

1. 材料与设备

1.1 材料

香榧壳，浙江省杭州市临安市场提供；氯化胆碱，分析纯，上海麦克林生化科技股份有限公司；1，2-丙二醇，分析纯，萨恩化学技术有限公司；实验室常规试剂。

1.2 设备

水浴恒温搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；电子天平，上海菁海仪器有限公司；高速中药粉碎机，济南亿健医疗设备有限公司；超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司；低速离心机，上海安亭科学仪器厂；紫外可见分光光度计，上海无析仪器有限公司；高压蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；超净台，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；THZ-92A汽浴恒温振荡器，上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；HWS型恒温恒湿箱，宁波东南仪器有限公司；数显鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

2. 实验与方法

2.1 标准曲线的绘制

称取芦丁10mg放入容量瓶中，加入75%乙醇溶液，置于超声波清洗机中将芦丁标准品超声充分溶解，溶解后定容成浓度为0.4mg/mL的芦丁标准液_{Zh71Ag8YdZQgWAXXymXiuaq8msYXCJZaVS3YX8CwgYg=}并保存备用。

分别量取上述0.4mg/mL芦丁标准液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，放入5支试管中，同时取1支空白试管作为空白对照组。在6支试管中先加入5%NaNO2溶液0.15mL，静置6min，再加入10%Al（NO3）3溶液0.15mL，静置6min，最后加入4%NaOH溶液2mL以及适量去离子水，使最后总体积为5mL，紧接着振荡摇匀，静置3min。以空白试管作为对照，在波长512nm下测定各个试管的吸光度。标准曲线如图1所示，其中纵坐标为吸光度，横坐标为芦丁黄酮含量。标准曲线的线性回归方程为：y=2.0379x-0.0175，相关系数R2为0.9965，线性拟合程度较好。

2.2 香榧壳总黄酮提取

低共熔溶剂具有低成本、低挥发性、可生物降解性、易于制备及良好的生物相容性等优势，可以弥补传统有机溶剂提取的缺点。因此，本实验选取低共熔溶剂作为黄酮提取的提取溶剂，利用超声辅助提取香榧壳总黄酮。

香榧外壳提取流程是：将干燥过的香榧外壳粉碎至一定目数，按照液料比，将配制好的低共熔溶剂与香榧壳粉末充分混匀，放置在超声波清洗机上超声提取一定时间。提取完毕后再将提取液利用离心机离心，去除大部分香榧壳粉末，其中待测液为上清液。

量取上述待测液1mL进行测定，按照标准曲线测定方式得到相应的黄酮含量。提取率计算方法如下：

上式中：Y为总黄酮提取率，mgRt/g；C为溶液质量浓度，mgRt/mL；V为提取液体积，mL；N为稀释倍数；m为粉末质量，g。

2.3 响应面优化实验

在前期实验的基础上进行三因素三水平的响应面优化实验。自变量A、B、C依次为液料比、超声时间、低共熔溶剂含水量，香榧壳总黄酮提取率为响应值，具体实验条件如表1所示。

3. 结果与讨论

3.1 响应面统计分析与模型拟合

选取粉碎度100目，低共熔溶剂为DES-1作为固定实验条件，然后对其他因素应用响应面优化实验，实验条件及结果如表2所示，回归模型方差分析见表3，筛选出提取工艺最佳的方案。

根据上述的实验结果，可以构建出一个关于三个影响因素A、B、C与总黄酮提取率（Y）之间的多元回归模型，所得到的方程如下：

Y=0.56-0.022A+0.00425B-0.012C-0.00275AB-0.00325AC+0.00025BC-0.13A2-0.20B2-0.13C2。

根据回归模型方差分析结果，模型决定系数R2=0.9730，R2adj=0.9384，表明该模型的相关性较好，实际值与预测值之间高度拟合，可信度较高。模型P值=0.0001（＜0.01），说明该模型具有显著性；失拟项P值=0.9435（＞0.05），不显著，表明该模型拟合度较好。根据F值可知，三个影响因素对总黄酮提取率的影响从大到小依次为液料比＞含水量＞超声时间。

3.2 响应面分析

3D响应曲面图和等高线图可以较好地描述自变量之间的交互作用，并反映出变量间的交互作用。通过观察曲面的倾斜程度，可以确定两个因素对响应值的影响程度。3D响应面图倾斜程度增加，意味着该因素对香榧壳总黄酮提取率的影响增强；椭圆形的等高线密集，表示两个因素之间的相互作用更强。具体3D响应面图与等高线图如图2所示。

通过观察三张3D响应面图可以得出，最大的响应曲面倾斜度为液料比，因此，对香榧壳总黄酮提取率影响较大的是液料比，与方差分析结果吻合。AC的响应曲面较为平缓，等高线较为稀疏，说明液料比与含水量的交互作用对响应值的影响不显著；AB、BC的响应曲面较为陡峭，且等高线比较密集，图形接近于椭圆形，说明液料比与超声时间（AB）、超声时间与含水量（BC）的交互作用对响应值的影响显著。

4. 结论

本文通过单因素试验得到不同因素对总黄酮提取率的影响，再进行响应面优化分析，以获得最优提取工艺。试验结果显示，最佳的提取工艺为：物料粉碎度为100目，氯化胆碱-甘油摩尔比为1：2，超声提取时间为40min，氯化胆碱-甘油含水量为20%，液料比为19mL/g。

基金项目：2023年浙江省“尖兵”“领雁”研发攻关计划项目（2023C02042）；2023年国家市场监督管理总局科技计划项目（2023 MK165）。

作者简介：杜黎丹（1983-），女，汉族，浙江富阳人，工程师，大学本科，研究方向为食品分析。