牛肉中磷酸腺苷含量的测定方法

牛肉的品质及变化与能量物质及伴随产生的产物相关，宰后早期肉品经过无氧酵解、肌原纤维蛋白降解（肉的成熟）过程，磷酸腺苷含量及代谢效率会对牛肉品质产生重要影响。研究发现，当磷酸腺苷水平不足时，会引发线粒体功能障碍，导致细胞发生凋亡，进而使肌肉中的纤维蛋白含量减少，这将直接影响牛肉的嫩度和质地。因此，通过测定屠宰后牛肉中磷酸腺苷含量及相关蛋白质的磷酸化水平差异，对于进一步确定牛肉品质差异具有重要意义。

磷酸腺苷包括三种主要形式，分别是三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）以及一磷酸腺苷（AMP）。肉产品中磷酸腺苷的分析方法主要有酶学法、色谱法和液质联用等，而样品前处理的结果会对分析指标、成本、效率产生直接影响。应用色谱法对牛肉中的磷酸腺苷进行测定时，由于牛肉等生物样品具有基质复杂、干扰物多、待测物浓度低等缺点，因此需对样品进行前处理，以去除潜在的干扰物质并富集待测组分，确保后续分析的准确性。因此，如何在复杂的牛肉基质中快速、准确地分离出磷酸腺苷并进行高效分析，成为当前研究的重要课题。

QuEChERS方法是一种应用广泛的样品前处理技术，具有快速、简单、廉价、有效、可靠和安全的特点。使用QuEChERS方法对样品进行预处理时，主要涉及萃取剂、脱水剂和净化剂的选择。硫酸镁和硫酸钠常用作脱水剂，可以显著降低水相，促进样品在有机相中的分布和两相的分层，从而有效地将水分从有机相中吸附出来，使目标化合物更纯净。在农药多重残留的分析中，常用的萃取剂有丙酮、乙腈和乙酸乙酯等。常用的吸附剂有乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基键合硅胶（C18）等，针对不同类型的杂质具有各自独特的清除效果。其中，PSA含有伯胺和仲胺，具有较强的结合能力和良好的选择性，能有效去除样品中的极性杂质和有机酸，特别是在去除碳水化合物和脂类物质时表现出色。C18则侧重于去除样品中的非极性物质和油脂，适用于脂溶性化合物较多的样品，去除脂类杂质效果显著，能使目标分析物的纯度大幅提升。随着方法的不断改进以及新材料的开发，QuEChERS可以针对不同样品使用不同的萃取剂、脱水剂、净化剂，但目前采用QuEChERS进行磷酸腺苷的测定未见相关报道。

石墨烯（Graphene）是一种新型二维纳米材料，具有较高的比表面积，能提供大量的表面吸附位点，有助于从复杂样品基质中高效提取目标化合物。同时，石墨烯拥有丰富的π电子体系，能与含苯环结构的化合物发生强烈的π-π堆积作用，从而增强对这类物质的吸附能力。因此，石墨烯可以作为一种理想的吸附剂。本研究基于QuEChERS方法，以石墨烯为净化剂，建立QuEChERS-Graphene-UPLC法测定牛肉中磷酸腺苷含量。研究结果可应用于牛肉中磷酸腺苷分离富集及检测，辅助进行牛肉肉质评定。

1. 仪器与材料

1.1 仪器

超高效液相色谱仪，美国Waters公司Acquity；高速离心机，德国Eppendorf 5810R；电子天平（精度0.0001g），METTLER公司AE240；多管涡旋混合仪，杭州奥盛仪器有限公司MTV-100。

1.2 材料

对照品：5’-三磷酸腺苷二钠盐（含量＞98%）、5’-二磷酸腺苷钠盐（含量＞98%）、5’-磷酸腺苷二钠盐（含量＞98%），日本东京化成工业株式会社；高氯酸、氨水、醋酸铵等均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；乙腈、甲醇（农残级），Fisher美国；0.22μm水系、有机过滤膜及0.22μm针筒式滤膜过滤器，天津津腾公司。

2. 实验与方法

2.1 样品前处理

精确称量新鲜牛肉样品5g（精确至0.001g），捣碎研磨后置于50mL离心管中，分为2份，每管添加15mL的6%冷高氯酸。采用涡旋振荡（1200rpm，10min）对样品进行前处理，然后完全浸泡10min，4500r/min冷冻离心10min，吸取2mL上清液进一步纯化。

2.2 纯化

从有机相中提取约2mL上清液，转移至5mL离心管中，分别在各管中加入不同量的石墨烯（A：空白；B：10mg石墨烯；C：25mg石墨烯）。涡旋振荡（1200rpm，10min），然后完全浸泡10min，4500r/min冷冻离心10min。取上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤至样品瓶内，供超高效液相色谱分析。

2.3 色谱条件

采用水质UPLC HSS T3柱（2.1×150mm，1.8μm）进行分析，流速0.30mL/min、柱温25℃、注样量10μL。流动相A：磷酸二氢铵水溶液，流动相B：乙腈-0.05mmol/L磷酸二氢铵水溶液（10：90），梯度洗脱。

2.4 定性与定量鉴定

分别准确称量ATP、ADP、AMP标准品各10mg，放入10mL测量瓶中，用4℃超纯水溶解，配制成浓度为1.0mg/mL的对照原液。将对照原液稀释至20、10、5、2、0.5μg/L，随后注入5个浓度梯度的控制溶液。以待测组分的质量浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）进行回归分析，得到ATP、ADP和AMP之间的线性关系。每个样品测量6次（n=6），计算各个样品的回收率和相对标准偏差。

2.5 数据的统计分析

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，结果以平均数±标准差表示，P＜0.05表示差异显著。

3. 结果与讨论

3.1 石墨烯处理效果比较

牛肉样品基质复杂，含有大量的蛋白质、脂肪和其他有机物，可能会干扰目标化合物的检测，采用吸附剂可以去除样品中的杂质，从而提高检测水平。本研究基于QuEChERS方法，采用石墨烯作为吸附剂进行前处理，结果如图1所示，能显著提高牛肉基质中杂质的纯化效果，有效降低背景干扰和基线噪声，使基线大大稳定。

石墨烯具有比表面积大、结构稳定、耐酸碱等性质，与其他常用填料（如C18、多壁碳纳米管）相比，其用量和洗脱液体积少，但目标物回收率高。本研究发现，10mg石墨烯即可达到较好的纯化效果，相同的结果在其他研究中也有发现。例如，同等量的C18不足以吸附目标物，容易发生穿透现象，因此所需的吸附剂量大大高于石墨烯。有人研究了石墨烯和石墨化炭黑（GCB）对于黄瓜中色素的吸附效果，结果表明，相比于GCB，石墨烯在去除色素方面具有更高的效率。目前利用石墨烯对肉类样品进行前处理的研究较少，本研究结果显示，石墨烯对牛肉样品中杂质的纯化效果较好，且用量少于传统吸附剂，在后续研究中将采用10mg石墨烯作为吸附剂，进一步考察方法的线性关系、检出限、定量限等。

3.2 色谱条件的改进

磷酸腺苷是两性化合物，极性较强，导致它与极性流动相的亲和力更大，与非极性固定相的作用较弱，故而在反向色谱柱上不能有效滞留或分离。为了提高磷酸腺苷在色谱分析中的分离效果，本研究对色谱条件进行了优化，以磷酸二氢铵缓冲液与乙腈作为流动相的组合，采用梯度洗脱的方式进行分离。其中，磷酸二氢铵缓冲液是为了提供稳定的pH环境，乙腈则通过与缓冲液的梯度洗脱，调节目标化合物的溶解性。通过一系列实验发现，当流动相的pH=6.7时，能够实现磷酸腺苷与样品中其他未知物质的良好分离，这种分离效果不仅能确保磷酸腺苷呈现出清晰峰形，还大大提升了定性和定量分析的准确性。

3.3 方法的线性关系、定量限和检出限

配制浓度分别为1、5、10、20、50、100μg/L的磷酸腺苷标准溶液，并对三种形式的磷酸腺苷（ATP、ADP、AMP）进行色谱检测，评估其线性关系。实验数据显示，三种磷酸腺苷在设定浓度范围内表现出优异的线性关系，相关系数（R²）均大于0.99，表明该方法具有高度的线性响应能力。三种磷酸腺苷的检测限为0.001-2.000μg/L，定量限为0.003-5.000μg/L。每个样品的检测时间较短，仅需15min。动物死亡后，ATP会迅速分解为ADP和AMP，然后进一步分解为嘌呤核苷酸和次黄嘌84a371c517f803d134414e1e88e431999ef6fa411b3b4628376ea96fc5b89255呤核苷酸，因此较低的检出限对于测定ATP及其代谢产物的含量具有重要意义，本方法能够满足实际检测需求。

综上所述，作为一种优质蛋白质的来源，牛肉因其低脂肪、高蛋白特性受到消费者欢迎。研究表明，牛肉中磷酸腺苷的含量对牛肉的风味、色泽、嫩度影响显著，定量测定牛肉中磷酸腺苷的含量具有重要的现实意义。为此，本研究基于QuEChERS方法，开发了一种超高效液相色谱（UHPLC）分析方法，以提高磷酸腺苷检测的准确性、灵敏性。该方法具有以下优点：（1）采用石墨烯作为吸附剂，可有效去除牛肉样品中的脂肪酸、氨基酸及色素等杂质，提高了检测的准确性和灵敏性，而且相较于其他吸附剂，石墨烯用量少，安全可靠；（2）实验只有称样、匀浆、离心、上机4个步骤，操作简单；（3）每个样品上机检测时间只需要15min。因此，本方法能够满足大批量样品检测的要求，可以在牛肉样品测定中推广应用，也为磷酸腺苷在其他生物样品中的检测提供了参考。

基金项目：2023年度河北北方学院基本科研业务费项目（JYT2023014）。

作者简介：段晓燕（1987-），女，汉族，河北阳原人，副研究员，硕士研究生，研究方向为畜牧学研究与教学管理。

*通信作者：刘宇（1987-），男，回族，陕西安康人，副研究员，博士，研究方向为非编码RNA与动物生长发育调控。