响应面法优化葛仙米多糖提取工艺研究

本文采用超声波协助酶法，对葛仙米类植物多糖进行了研究，同时结合响应面法优化了葛仙米多糖的提取工艺，以期为葛仙米及其多糖成分的深入研究和开发提供一定的数据支撑。

1. 实验与方法

1.1 葡萄糖含量测定

在100mL容量瓶中加入10mg葡萄糖粉末，再加入蒸馏水至刻度线下1cm，静置1min，然后用胶头滴管缓慢补加蒸馏水，定容至刻度线，充分摇匀，静置，得到0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液。用移液管移取葡萄糖标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于10mL定量瓶中，并分别加入蒸馏水定容至2mL，同时直接加蒸馏水2mL于定量瓶中作为空白对照组。再加入5%苯酚溶液1mL，轻微振摇，使其与葡萄糖溶液混匀；用移液管吸取7mL浓硫酸，并将其沿试管壁缓慢加入，振摇，放置15min，冷却至室温。

利用紫外可见分光光度计，在490nm波长下测定葡萄糖标准溶液的吸光度，并进行空白对照，绘制x轴为葡萄糖质量浓度（μg/mL），y轴为吸光度（A）的相关标准曲线。

1.2 葡萄糖标准曲线制作

在490nm处测定的标准葡萄糖溶液的吸光度数值如表1所示。标准曲线的线性方程为y=0.0179x-0.0924，R2=0.9921，具体如图1所示。葛仙米多糖的质量浓度可依据葡萄糖标准曲线计算。葛仙米多糖得率的计算公式如（1）所示。

（1）

该公式中，P为葛仙米多糖得率；C为溶液中葛仙米多糖的质量浓度（mg/mL）；V为溶液的体积（mL）；F为多糖的稀释倍数；m为多糖样品的质量（mg）。

1.3 葛仙米多糖含量测定

量取200mL蒸馏水，与事先粉碎并筛好的葛仙米粉末混合置于250mL具塞锥形瓶中。将事先称取的不同质量的纤维素酶分别放置于20mL小烧杯中，依次加入少量蒸馏水，搅拌均匀。将溶液pH调为5，放入水浴锅中50℃酶解30min。在改变超声时间和超声温度的条件下进行实验，对不同超声时间和超声温度条件下得到的样品进行编号，以作区分，并冷却至室温。利用离心机将液体与葛仙米固体颗粒进行分离，转速为8000r/15min，待机器完全停止后取出上清液。吸取1mL上清液放入小烧杯中，稀释至6倍。将稀释后的葛仙米多糖样品用移液管移取至1-10mL定量瓶中，先后分别加入5%的苯酚溶液1mL。用移液管移取浓硫酸7mL，并将其沿瓶壁缓慢加入定量瓶中；用胶头滴管移取少量蒸馏水定容至刻度线，振荡摇匀，静置15min，冷却至室温。通过紫外分光光度计测定葛仙米多糖溶液的吸光度，并将测出的数值带入式（1）中，计算出葛仙米多糖得率。

1.4 单因素试验

1.4.1 纤维素酶的添加量。称取粉碎后的葛仙米干品，放入250mL具塞锥形瓶中，量取200mL蒸馏水加入其中。固定超声温度为90℃、超声时间为60min，控制纤维素酶的添加量，分别加入10、15、20、25、30mg于锥形瓶中，并根据所测吸光度得出相对情况下的葛仙米多糖得率。以纤维素酶的添加量（x）和葛仙米多糖得率（y）建立标准曲线，以直观确定最佳条件。

1.4.2 超声时间。称取粉碎后的葛仙米干品，放入250mL具塞锥形瓶中，量取200mL蒸馏水加入其中。固定超声温度为90℃、纤维素酶的添加量为20mg，控制超声时间，分别设置为30、60、90、120、150min，并根据所测吸光度得出相对情况下的葛仙米多糖得率。以超声时间（x）和葛仙米多糖得率（y）建立标准曲线，以直观确定最佳条件。

1.4.3 超声温度。称取粉碎后的葛仙米干品，放入250mL具塞锥形瓶中，量取200mL蒸馏水加入其中。固定超声时间为60min、纤维素酶的添加量为20mg，控制超声温度，分别设置为80、85、90、95、100℃，并根据所测吸光度得出相对情况下的葛仙米多糖得率。以超声温度（x）和葛仙米多糖得率（y）建立标准曲线，以直观确定最佳条件。

1.5 Box-Behnken设计响应面法优化葛仙米多糖提取工艺

本实验运用Design-Expert软件设计研究，选取的3个考察因素分别为纤维素酶的添加量（A）、超声温度（B）、超声时间（C），编码水平为-1、0、1，且响应值为葛仙米多糖得率，用以得到三oK65f7fgpog9WJbrbZ+uLw==合一水平的响应面优化设计方案，如表2所示。

2. 结果与分析

2.1 单因素试验分析

2.1.1 纤维素酶添加量的影响。固定葛仙米多糖提取的超声温度为90℃、超声时间为60min，当添加纤维素酶10-20mg时，多糖得率不断增加，且在20mg时达到最高点；添加至30mg时，多糖含量逐渐减少。由此可知，添加20mg纤维素酶为提取多糖最佳条件。

2.1.2 超声温度的影响。固定葛仙米多糖提取的纤维素酶添加量为20mg、超声时间为60min，在超声温度为80℃-95℃时，葛仙米多糖得率逐渐增加，说明温度的升高有利于多糖的析出；在超声温度为95℃-100℃时，葛仙米多糖得率缓慢减少，且在95℃附近达到最高值。因此，将温度控制在95℃左右最为适宜。

2.1.3 超声时间的影响。固定葛仙米多糖提取的纤维素酶添加量为20mg、超声温度为90℃，在超声时间为30-90min时，葛仙米多糖含量总体呈递增状态；在90-150min时，多糖得率逐渐下降。由此可知，在60-90min超声时间内，多糖得率最高，故将处理时间控制在此区间内最为适宜。

2.2 响应面优化及分析

在Design-Expert软件中，利用Box-Behnken设计实验，优化响应面法。输入3个因素与编码水平，通过不同实验得到葛仙米多糖得率。实验设计如表3所示，响应面模型结果方差分析如表4所示。

利用Design-Expert软件对表3中因素水平的实验结果进行回归分析，可以得到纤维素酶的添加量（A）、超声温度（B）、超声时间（C）对响应值葛仙米多糖得率（Y）的回归方程为：Y=5.48+0.36A+0.68B+0.59C-0.25AB-0.22AC+0.45BC-1.25A2-0.78B2-0.55C2。从表4数据可知，葛仙米多糖模型为0.00052，P值小于0.05，说明模型显著；A2、B2的值分别为0.0002、0.0029，小于0.01，说明其关系较显著；模型中相关系数R2=0.7780，Radj=0.9030，小于0.2，说明模型较好，实际误差较小，试验的3个因素能够反映与葛仙米多糖得率间的关系。

实验发现，适宜的葛仙米多糖提取工艺条件为：纤维素酶20mg、超声温度96℃、超声时间84min，此条件下的葛仙米多糖得率为5.9%。

基金项目：2023年湖北省高等学校实验室研究项目“基于生态校园下中药学专业实践教学平台的构建——以武汉生物工程学院为例”（HBSY2023-093）；2023年校级教学改革研究立项“基于生态校园下医药学院专业实践教学新体系的构建”（2023J49）。

作者简介：游林红（1973-），女，汉族，湖北武汉人，高级实验师，硕士研究生，研究方向为微生物抑菌中药材有效成分的提取、分离、鉴定等。

*通信作者：黄帅（1985-），男，汉族，湖北武汉人，副教授，博士，研究方向为药用植物资源的开发与利用。