酶解提取-高效液相色谱-电感藕合等离子体质谱法测定富硒食品中的有机硒组分

作为人体必需的微量元素之一，硒的形态与其生物功能密切相关。无机硒的毒性大、活性低，多以硒酸盐和亚硒酸盐的形式存在；有机硒的毒性小、生物活性高，多以硒蛋白、硒代氨基酸、硒多糖以及硒核酸等形式存在。随着人们对硒的重视程度的提高，市场上出现了越来越多的富硒产品，但是目前我国检测硒的标准是针对总硒或无机硒，对人体有益的有机硒的检测还暂无标准。通过文献查询发现，目前对有机硒形态检测方法的研究集中在液相色谱-电感耦合等离子体质谱法、电泳-电感耦合等离子体质谱法、液相色谱串联质谱法、ICP-MS与飞行时间质谱结合的方法等方面。本研究旨在通过酶解法，将食品中所含有的、以不同形式存在的有机硒转化为硒代氨基酸，利用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法对其进行形态分离并定量，从而为市售食品有机硒的形态检测提供参考。

1. 仪器与试剂

1.1 仪器

1260高效液相色谱-NexION 1000电感耦合等离子体质谱仪，美国PE公司；Milli-Q超纯水机，美国密理博公司；Sigma4-16KS高速离心机，德国Sigma公司；ME204E、ME155DU分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；VORTEX3旋涡混匀器，德国IKA公司；恒温水浴振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司。

1.2 试剂

甲醇，色谱纯；三氟乙酸，分析纯；乙烷磺酸，分析纯；盐酸，分析纯；三羟甲基氨基甲烷，分析纯；蛋白酶液：CAS9014-01-1，IUB3.2.21.14，300U/mL-400U/mL，不得含丙三醇稳定剂；硒代胱氨酸，纯度≥98%；甲基-硒代半胱氨酸，纯度≥98%；硒代蛋氨酸，纯度≥98%；无机硒储备液，100mg/L。

2. 试验与方法

2.1 溶G26TyKA+MkpmGTLgYnbg5w==液配制

2.1.1 有机硒标准溶液储备液（100mg/L）：分别精密称取硒代胱氨酸、甲基-硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸10.2mg于100mL容量瓶中，用一级水定容。

2.1.2 有机硒标准溶液中间液（1mg/L）：取1mL储备液至100mL容量瓶中，用一级水定容。

2.1.3 无机硒中间液：取无机硒储备液1mL于100mL容量瓶中，用一级水定容。

2.1.4 硒混和工作液：用0.05mol/L的MES-RTIS缓冲液稀释标准中间液，得到质量浓度为5、10、20、50、100µg/L的有机硒标准工作溶液，每个浓度的标准液中的无机硒浓度均为20µg/L。

2.1.5 流动相溶液（98%三氟乙酸水溶液（0.2%v/v）-2%甲醇）：取3.92mL三氟乙酸，加入1000mL一级水、40mL甲醇，一级水定容至2000mL，过0.45μm有机系滤膜，超声脱气10min。

2.1.6 氢氧化钠溶液（1mol/L）：称取4g氢氧化钠，用水稀释至100mL，混匀。

2.1.7 氢氧化钠溶液（6mol/L）：称取24g氢氧化钠，用水稀释至100mL，混匀。

2.1.8 盐酸溶液（1mol/L）：称取8.33mL盐酸，用水稀释至100mL，混匀。

2.1.9 0.05mol/L的MES-RTIS缓冲液：称取19.52g的2-（N-吗啉代）乙烷磺酸和12.2g的三羟甲基氨基甲烷，用1.7L水溶解，根据室温用6mol/L氢氧化钠溶液调节pH为8.3，加水稀释至2L。

2.1.10 蛋白酶溶液：用0.05mol/L的MES-TRIS缓冲溶液配置成为50mg/mL的蛋白酶溶液，使用前现配并于0℃-5℃条件下暂存。

2.2 样品前处理

将食品可食部分经高速粉碎机粉碎均匀，称取0.2-1.0g于50mL耐120℃离心管中，准确移取并加入0.05mol/L的MES-RTS缓冲液20mL，加入50mg/mL蛋白酶100uL，加盖密封，涡旋5min混匀。于60℃水浴摇床水浴振摇10min，开盖，加入3mol/L乙酸溶液2.5mL，控制试样温度保持在（60±1）℃，用1mol/L氢氧化钠溶液或者1mol/L盐酸调节试样pH至4.5±0.2，持续酶解2h，中间每0.5h取出摇匀1次。取出冷却后，5000r/min离心10min，取上清液，过0.45μm有机系滤膜，待测，同时作空白试验。

2.3 仪器条件

2.3.1 液相色谱条件：C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：98%三氟乙酸水溶液（0.2%v/v）-2%甲醇，等度，流速为1.0mL/min、进样量为100μL、柱温为30℃。

2.3.2 ICP-MS条件：功率为1600W、采样深度为8mm、雾化室温度为2℃、等离子体气流量为17mL/min、辅助气流量为1.2mL/min、载气流量为0.95mL/min、检测质荷比（m/z）为78。

3. 结果与分析

3.1 方法线性关系、检出限和回收率

本研究建立的食品中3种硒氨基酸的检出限均为0.04mg/kg，定量限为0.12mg/kg；在5-100µg/L之间，线性良好；相关系数均在0.999以上，10倍定量限浓度的添加回收率为84.2%-116.0%。详见表1。

3.2 前处理过程的优化

3.2.1 色谱条件的选择。首先选择离子色谱柱Hamilton PRP-X100，以柠檬酸铵-甲醇为流动相，结果硒代蛋氨酸（SeMet）的分离效果不理想，出峰时间长，存在分离度低、拖尾等情况；无机硒与硒代胱氨酸（SeCyS2）不能完全分开，通过调节流动相pH及有机相比例仍无法改善。将流动相更换为三氟乙酸水溶液-甲醇后，虽然可以分离，但出现响应较低的情况。选用C18反相色谱柱后，分别尝试不同的流动相，发现流动相为三氟乙酸水溶液（0.2%）-甲醇（98：2，V：V）时，各组分的分离度较高，且响应值较高，如图1所示。

3.2.2 前处理的优化。为防止高温、浓酸等极端条件导致有机硒向无机硒转化，提取液选择相对温和的水、0.1mol/L的盐酸、无水乙醇、0.05mol/L的MES-RTIS缓冲液+蛋白酶，以此进行对比研究。提取过程中，加入提取时间和提取温度作为变量进行考察。交叉实验证实，0.05mol/L的MES-RTIS缓冲液+蛋白酶在常温下振荡提取120min和160min的差异不大，考虑时间成本问题，将提取时间定为120min，详见表2。在固定时间和提取液的情况下，通过对不同温度下不同样品的提取效果进行对比，发现在60℃时，每种产品的3种有机硒氨基酸提取量最大，即该温度为最佳提取温度，详见表3。

酶提取效果优于其他提取液，主要是因为生物体内的大部分硒以结合蛋白的形式存在，通过蛋白酶的酶解，可以释放出更多的硒氨基酸。最佳提取温度的确定和实验中所使用酶的来源密切相关，不同来源酶的最佳活性温度有较大差异，本研究中选用的是枯草杆菌蛋白酶，其最佳活性温度为50℃-60℃。

综上所述，本研究建立的高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法提取方法简单、高效，且检出限低、线性范围宽、各组分分离效果好，能够满足富硒食品和特殊医学配方乳粉中硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸及L-甲基硒代半胱氨酸的形态检测，同时可为市场上以添加无机硒冒充富硒食品的执法治理提供技术支持。

作者简介：邱险辉（1983-），男，汉族，广东梅州人，工程师，大学本科，研究方向为食品及食用农产品质量安全检测。

*通信作者：张秀芹（1974-），女，汉族，黑龙江双鸭山人，正高级兽医师，博士，研究方向为食品、饲料、兽药质量安全检测技术及应用。