基于铁基γ-环糊精纳米粒子的类过氧化物酶活性比色检测肌氨酸

摘要 采用溶剂热法合成了具有类过氧化物酶活性的铁基γ-环糊精纳米粒子（Fe-γ-CD），并基于此构建了简单、灵敏测定肌氨酸（SAR）的比色传感方法。Fe-γ-CD 可催化过氧化氢（H2O2）氧化无色的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB），生成蓝色的氧化态TMB（oxTMB），在652 nm 处有强吸收峰。考察了反应条件对Fe-γ-CD催化的TMB-H2O2 显色反应的影响，并进行了催化机理和稳态动力学分析。实验结果表明， Fe-γ-CD 催化H2O2 产生羟基自由基、单线态氧和超氧自由基，这些活性氧物种进一步氧化TMB，此催化反应历程遵循典型的Michaelis-Menten 动力学模型。SAR 在肌氨酸氧化酶（SOx）催化下可水解产生H2O2，具有类过氧化物酶活性的Fe-γ-CD 催化H2O2 氧化TMB，使得溶液颜色变蓝，并且在652 nm 处的吸光度增加，吸光度升高程度与SAR 的浓度有关，由此可对SAR 浓度进行定量检测。本方法的线性检测范围为1.0～70.0 μmol/L，检出限为0.46 μmol/L（S/N=3），并具有良好的特异性。将本方法用于血清中SAR 含量的测定，结果令人满意。

关键词 铁基γ-环糊精纳米粒子；肌氨酸；过氧化氢；比色

肌氨酸（Sarcosine， SAR）是胆碱代谢为甘氨酸过程中产生的代谢产物，人体内SAR 浓度异常会诱发肾功能衰竭、肌氨酸血症和前列腺癌等多种疾病。目前， SAR 已被证实可作为早期前列腺癌的临床标志物，相比于前列腺特异性抗原测试， SAR 的差异表达能够更准确地区分前列腺癌的不同发病阶段[1-3]。因此，建立简单、高效和灵敏的SAR 检测方法对于相关疾病诊断和人体健康监测具有重要意义。

目前，研究者已将色谱-质谱联用[4-6]、微分迁移率分析-质谱联用[7]和毛细管电泳-质谱联用[8]等技术用于SAR 的定量检测。这些方法的灵敏度和准确性较高，但所用仪器昂贵，样品处理过程复杂，并且需要专业的操作人员。肌氨酸氧化酶（SOx）可以催化O2 氧化SAR，产生甘氨酸、甲醛和过氧化氢（H2O2）。基于对O2 消耗量或H2O2 生成量的测定，研究者开发了更简便、快捷的SAR 间接检测方法，如电化学法[9-11]、表面增强拉曼散射法[12]、荧光法[13-15]和比色法[16-19]等。其中，比色法由于操作简单、检测成本低和结果可视化等优势，在SAR 检测过程中广泛应用。目前报道的比色法主要基于SOx 与辣根过氧化物酶（HRP）或其模拟酶的级联反应进行SAR 检测，其原理如下：SOx 催化SAR 氧化产生H2O2， H2O2 进一步在过氧化物酶的催化下氧化显色底物，输出比色信号。但是，天然的HRP 难以循环利用且易失活，研究者利用聚合物将HRP 与SOx 共同固定在试纸上，构建了较稳定和灵敏的SAR 检测方法，检出限（LOD）低至0.6 μmol/L[18]。利用理化性质更稳定且可大量制备、活性易调控、种类多样、成本低的纳米酶，可构建更简便且稳定的SAR 比色检测体系。目前，大多数纳米酶的催化活性低于天然HRP，导致SAR 检测灵敏度不高。为了满足实际样品中低浓度SAR 检测的需求，多数基于纳米酶的SAR 比色检测法仍需对酶进行固定化以产生限域效应[19]，或者以高消光系数的贵金属纳米棒为显色底物[17]来提高灵敏度，但是同时也增加了操作难度和检测成本。

铁基纳米酶是最早被发现具有类过氧化物酶活性的纳米酶[20]，因具有低成本、高效且催化性能易调控等优点，在生物传感领域具有显著的应用优势[21]。目前，已经报道的铁基类过氧化物纳米酶包括金属氧/硫化物、金属-有机框架（MOF）和单原子纳米酶等[21-23]。Xu 等[24]以三磷酸腺苷活化的Fe3O4@MIL-100（Fe）为类过氧化物酶，通过对H2O2 的检测而实现胆固醇的间接检测；Xu 等[25]将葡萄糖氧化酶固定在具有类氧化酶活性的Fe-MOF 上，实现了葡萄糖的检测。尽管如此，采用简便方法获得催化活性高、稳定且分散性良好的铁基纳米酶仍具有挑战性。环糊精（CD）含有丰富的官能团且分子内部存在空腔，可以结合或包埋多种无机纳米粒子，赋予材料较高的稳定性和水溶性[26]。Salvatore等[27]通过光照β-CD和Pt 盐获得了小尺寸、高水溶性的β-CD 保护的Pt 纳米粒子；Setareh 等[28]以α-、β-和γ-CD 为保护剂、NaBH4 为还原剂，合成了α-、β-和γ-CD 保护的银纳米粒子，其中， γ-CD 保护的银纳米粒子具有更优异的稳定性。然而， CD 保护的铁基纳米酶及其生物传感应用鲜有报道。

本研究以六水合氯化铁（FeCl3·6H2O）和γ-CD 为前驱体，通过简单的溶剂热法一步合成了具有优异类过氧化物酶活性的铁基γ-环糊精纳米粒子（Fe-γ-CD）。Fe-γ-CD 可催化H2O2 产生羟基自由基（·OH）、单线态氧（1O2）和超氧自由基（O2·–），这些强氧化性的活性氧物种（ROS）可将无色3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）氧化为蓝色产物。由于H2O2 可通过SOx 催化SAR 水解产生， Fe-γ-CD 催化的H2O2-TMB 显色反应可用于SAR 的比色检测。本方法检测灵敏度高且特异性好，可用于血清中SAR 浓度的测定。