醋酸洗必泰/氧化石墨烯复合物的抗菌性能研究

摘 要：【目的】研究醋酸洗必泰/氧化石墨烯复合物的抗菌性能。【方法】采用Brodie法所制备得到氧化石墨烯，使用插层改性的方法合成醋酸洗必泰/氧化石墨烯复合物。运用XRD和FTIR表征复合物的结构，同时借助体外抗菌试验评价复合物的抗菌性能。【结果】与氧化石墨烯对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌率相比，复合物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌率分别提高了约11.5倍和7.7倍。【结论】醋酸洗必泰的引入可大幅度提高氧化石墨烯的抗菌活性。

关键词：氧化石墨烯;醋酸洗必泰;复合物;抗菌性能

中图分类号：TB33" " "文献标志码：A" " 文章编号：1003-5168（2024）14-0076-04

DOI：10.19968/j.cnki.hnkj.1003-5168.2024.14.015

Antibacterial Property of Chlorhexidine Acetate/Graphene Oxide

Composite

Abstract： [Purposes] This paper aimed to investigate the antibacterial property of chlorhexidine acetate/graphene oxide composite. [Methods] Graphene oxide was prepared using Brodie method. Subsequently， chlorhexidine acetate/graphene oxide composite was synthesized by intercalation modification method. The structure of the composite was characterized using XRD and FTIR， and the antibacterial property of the composite was evaluated through in vitro antibacterial experiment. [Findings] Compared with the antibacterial rate of graphene oxide against escherichia coli and Staphylococcus aureus， the antibacterial rate of the composite against escherichia coli and Staphylococcus aureus increased by ca. 11.5 and 7.7 times， respectively. [Conclusions] The introduction of chlorhexidine acetate could significantly improve the antibacterial activity of graphene oxide.

Keywords： graphene oxide; chlorhexidine acetate; composite; antibacterial property

0 引言

抗菌材料指的是一种拥有抑制甚至杀灭微生物功能的材料，通常包括天然类、有机类和无机类等［1］。其中，天然类抗菌材料具备安全且无毒等优点，是人类使用较早的抗菌材料，如壳聚糖、山梨酸、芥末、蓖麻油、山葵等。然而，天然类抗菌材料存在难加工、耐热性较差、易受环境条件影响等问题，迄今未得到广泛应用。有机类抗菌材料是具有优良杀菌效应的抗菌材料，如有机金属类、有机卤代物等，但其耐高温性差、易迁移，使用上存在一定的限定性。无机类抗菌材料是20世纪80年代发展的一类抗菌材料，如金属抗菌剂、光催化抗菌剂和纳米抗菌剂等，具有表现出良好耐热性、持久性和安全性等优点。在无机类抗菌剂中，研究得最多且开发得较快的是银系无机抗菌剂，这是由于其杀菌能力强，杀菌强度约为锌的1 000倍。此外，银系无机抗菌剂具有耐热性好、抗菌谱广、有效抗菌期长、毒性较低、不会产生耐药性等优点，但也存在易变色、成本高、制备相对困难等缺点。

在众多的无机类抗菌候选材料中，石墨烯及其衍生物具有优异的物理和化学性能［2］。氧化石墨烯作为石墨烯衍生物之一，一方面，其表面含有大量含氧官能团，提高了它的分散性，并为其表面功能化提供了结合位点。另一方面，氧化石墨烯具有与细胞较为相近的尺寸、低毒性、良好生物相容性等特点。因此，氧化石墨烯作为一种新型的、性能优异的无机类抗菌材料，在生物学和医学等领域中得到了广泛应用［3］。Hu等［4］首次研究并证明了氧化石墨烯具有一定的抗菌活性，这可能与氧化石墨烯的表面电荷和含氧官能团有关。Liu等［5］对比研究了石墨、氧化石墨、氧化石墨烯和还原氧化石墨烯水相分散液的抗菌性。结果表明，氧化石墨烯表现出较好的抗菌能力，这种抗菌能力与培养时间和材料浓度有着紧密的联系。总的来说，氧化石墨烯的抗菌性与其理化性能密切相关。Mangadlao等［6］发现，氧化石墨烯层数的增加可提高其抗菌性，这可以归结于其表面性能发生改变。尽管如此，单一组分的氧化石墨烯没有足够和持续的抗菌效果，还需要对其进一步研究。

醋酸洗必泰（Chlorhexidine acetate，CA），又被称为醋酸氯己定，是阳离子表面活性剂，具有抗菌谱广、抗菌作用较强的特点。CA的作用机制是其对细菌有明显的亲和力，能结合到细菌的细胞膜表面，改变膜的渗透性，造成细胞内物质流出，从而杀灭细菌［7］。以无机载体负载CA可有效增强无机载体基材的抗菌能力。孟娜等［7］通过将CA负载到蒙脱土载体，获得了醋酸洗必泰改性蒙脱土抗菌复合物。结果表明，CA的引入可有效提高蒙脱土的抗菌活性。同时，作为载体的蒙脱土能使CA的抗菌时效加长，并提高CA的热稳定性。本研究采用Brodie法所制备得到氧化石墨烯，随后，使用插层改性的方法合成CA/氧化石墨烯复合物。运用XRD和FTIR表征复合物的结构，并借助体外抗菌试验评价复合物的抗菌性能。

1 试验

1.1 试剂与仪器

试剂：CA，分析纯，台山市粤侨试剂塑料有限公司；天然石墨粉、氯酸钾、发烟硝酸、无水乙醇、氯化钠，全部为分析纯，全部来自广州化学试剂厂；大肠杆菌（ATCC 8099）、金黄色葡萄球菌（ATCC 6538），全部来自广东省微生物研究所。

仪器：DF-101Z型的加热恒温磁力搅拌器，上海凌科实业发展有限公司；JIDI-20D型的台式高速离心机，广州吉迪仪器有限公司；LanJ-6P5型的台式高功率超声波清洗仪，广东蓝鲸超声波清洗技术有限公司；L6-86型的冷冻干燥仪，长沙开谱仪器有限公司；DHG-9050A型的恒温干燥箱，上海合恒仪器设备有限公司；HT-120B型的恒温培养箱，上海赫田科学仪器有限公司；ARL EQUINOX 1000型的台式XRD粉末衍射仪，赛默飞世尔科技公司；ALPHA Ⅱ型的傅里叶变换红外光谱仪，钛洛科学器材（上海）有限公司。

1.2 氧化石墨烯的制备

氧化石墨烯（GO）采用Brodie法制备得到［8］。先往反应釜中加入一定量的发烟硝酸，在磁力搅拌作用下加入天然石墨粉。待充分搅拌均匀后，低温下（lt; 5 ℃）逐渐加入一定量的氯酸钾（lt; 0.5 g/min）。结束后，将体系温度升至30 ℃，恒温反应48 h。待反应完毕后，将体系冷却至室温，离心得到固体，将固体洗涤至中性，干燥，得到GO。

1.3 CA/GO复合物的制备

使用插层改性的方法合成CA/GO复合物。先称取1 g GO于一定量的蒸馏水中，超声分散2 h。完毕后，再加入一定量的氯化钠，继续超声处理30 min，对GO进行钠离子修饰。结束后，离心、洗涤、干燥，得到钠离子修饰GO。

将上述的钠离子修饰GO重新分散在一定量的无水乙醇中，超声处理1 h。完毕后，再加入一定量的CA，在70 ℃下恒温搅拌反应8 h。结束后，离心，洗涤，干燥，得到CA/GO复合物。

1.4 表征及测试

1.4.1 XRD粉末衍射法。采用台式XRD粉末衍射仪测试样品（Cu Kα射线波长为0.154 051 nm）。其中，电压为40 kV，电流为20 mA，扫描速度为2°/min。

1.4.2 傅里叶变换红外光谱法（FTIR）。采用FTIR测试样品。把适量的样品和溴化钾粉末充分研磨均匀后，压片。

1.4.3 体外抗菌试验。将一定量的待测物分散在100 mL 0.9 wt%无菌盐水（含有约107 CFU/mL大肠杆菌或金黄色葡萄球菌）中，然后在（37±1） ℃下振荡上述溶液。接触24 h后，取出1.0 mL悬浮液，并通过稀释法将其稀释至一定体积，以确保生长的菌落能够容易且正确地被计数。将稀释后的溶液置于LB琼脂平板上，并在（37±1） ℃下孵育24 h。最后，计数每个平板上的菌落数。抗菌率（η）计算公式见式（1）。

η=（Y－X） /Y×100% （1）

式中：Y是对照组（0.9 wt%无菌盐水）上的微生物菌落数；X是待测物上的微生物菌落数。每组试验重复3次，结果以（平均值±标准差）来表示。

2 结果与讨论

2.1 XRD分析

样品的XRD图谱如图1所示。由图1可知，天然石墨粉在2θ=26.8°处出现了尖而强的特征衍射峰，它对应了层间距为0.332 nm的（002）晶面。在GO的XRD图谱中，已观察不到天然石墨粉的衍射峰，同时在2θ=13.6°处出现了新衍射峰，它对应了层间距为0.601 nm的（002）晶面，这表明已成功氧化天然石墨粉［9］。对于CA/GO复合物，属于GO的衍射峰位置从2θ=13.6°向左移动至2θ=10.9°。根据布拉格方程，可计算得出GO的层间距从0.601 nm增加至0.742 nm，这可归结于插入的CA分子使得GO的层间距变大［10］。与GO相比，CA/GO复合物的结晶度有所降低，这表明CA的插层对GO的结晶度有一定影响。XRD分析结果证明了CA已成功插入GO层间，从而获得CA/GO复合物。

2.2 FTIR分析

样品的FTIR图谱如图2所示。由图2可知，GO样品在3 500 cm-1处出现一个宽而强的吸收峰，它属于O-H的伸缩振动，这可能是来源于吸收在GO里的水分子所致。在1 614、1 375和1 024 cm-1处的特征峰分别对应C=C、C-OH和C-O-C振动频率，这些含氧基团的出现表明天然石墨粉已被成功氧化为GO［9］。对于CA，在1 531和1 475 cm-1处出现了属于苯环的特征吸收峰，这可归结于CA分子中的苯环结构。对于CA/GO，可同时观察到分别属于GO和CA的官能团特征峰，这表明CA和GO已经相结合，从而成功制备CA/GO复合物，这些与XRD分析结果相符合。

2.3 体外抗菌性能分析

采用平板计数法来量化样品对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌性能。菌落定量数据见表1、表2，分别展示了不同样品与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌接触24 h后的抗菌活性。

根据抗菌率的计算公式，可以得到GO和CA/GO复合物对大肠杆菌的抗菌率分别为（6.8 ± 1.3）%和（85.2 ± 2）%。与GO相比，CA/GO复合物对大肠杆菌的抗菌率提高了约11.5倍。这表明GO具备较弱的抗菌活性，其杀菌机理可归结于GO的物理和化学作用，导致细菌死亡［6］。CA具有较强的广谱抗菌性，可表现出良好的抗菌活性。CA的抗菌机理可归结于其可结合到细菌细胞膜表面，改变膜的渗透性，造成细菌细胞内物质流出，从而达到抗菌目的［7］。当引入CA后，CA/GO复合物表现出显著增强的抗菌效果。

根据抗菌率的计算公式，可以得到GO和CA/GO复合物对金黄色葡萄球菌的抗菌率分别为（11.2 ± 2.1）%和（97.6 ± 1.2）%。与GO相比，CA/GO复合物对金黄色葡萄球菌的抗菌率提高了约7.7倍。基于上述相同的抗菌机理，GO和CA/GO复合物对金黄色葡萄球菌的行为响应也表现出了和大肠杆菌类似的规律。此外，与金黄色葡萄球菌相比，大肠杆菌有一层肽聚糖层的外膜，它能够保护细菌细胞免受外来物质的攻击［11］。因此，GO和CA/GO复合物对大肠杆菌的抗菌活性均较低。

总的来说，体外抗菌试验的结果表明，CA/GO复合物不仅对革兰氏阴性菌有优良的抗菌效果，而且对革兰氏阳性菌也有明显的抗菌作用，这证明了CA/GO复合物具有一定的广谱抗菌性。

3 结论

通过研究醋酸洗必泰/氧化石墨烯复合物的抗菌性能，结果表明：CA分子成功插入至GO层间，其引入可大幅度提高GO的抗菌活性，CA/GO复合物表现出显著增强的抗菌效果。

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