基于营卫学说探究类风湿关节炎与Tfh/Tfr细胞失衡的相关性

【摘 要】目的：从营卫学说角度阐述滤泡辅助性T细胞（Tfh）/滤泡调节性T细胞（Tfr）失衡与类风湿关节炎中医病机之间的联系。方法：选取2021年9月至2022年12月在南京中医药大学附属中西医结合医院风湿免疫科就诊的门诊及住院类风湿关节炎患者62例，搜集患者一般情况、病史资料、中医辨证信息及血清样本。检测符合入选标准患者的空腹Tfh细胞比例、Tfr细胞比例、白细胞介素（IL）-21水平，描述营卫失调证候积分、Tfh细胞比例、Tfr细胞比例、Tfh/Tfr细胞比值与IL-21在类风湿关节炎患者中的分布，分析营卫失调证候积分、Tfh细胞比例、Tfr细胞比例、Tfh/Tfr细胞比值、IL-21等指标之间的相关性。结果：类风湿关节炎患者营卫失调证候积分与年龄、病程、红细胞沉降率、免疫球蛋白A、关节压痛数、健康评估问卷评分、28个关节病情活动指数评分呈正相关（P < 0.05）；类风湿关节炎患者的Tfh/Tfr细胞比值、IL-21与营卫失调证候积分呈正相关（P < 0.05），Tfr细胞与营卫失调证候积分呈负相关（P < 0.05）。结论：营卫失和是类风湿关节炎发生、发展的基本病机，影响患者病情。营卫失和可与Tfh/Tfr细胞失衡对应，Tfh/Tfr细胞平衡可能属于营卫和调在现代理论下的具象体现。

【关键词】 类风湿关节炎；营卫学说；营卫失和；滤泡辅助性T细胞；滤泡调节性T细胞

Exploring the Correlation Between Rheumatoid Arthritis and Tfh/Tfr Cell Imbalance Based on the Ying-Wei

Theory

YANG Qing-ya，ZHANG Fang，YANG Ning，CHEN Chang-yun，XU Chao

【ABSTRACT】Objective：To elucidate the relationship between rheumatoid arthritis and Tfh/Tfr cell imbalance based on the Ying-Wei Theory.Methods：Sixty-two outpatients and inpatients with rheumatoid arthritis were selected who visited the Rheumatology and Immunology Department of Nanjing Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital from September 2021 to December 2022.General information，medical history，TCM syndrome differentiation information，and serum samples were collected from the patients.Detected the fasting Tfh cell and Tfr cell ratio，and interleukin-21 levels of patients who meet the inclusion criteria，described the ying-wei disharmony syndrome score，Tfh cell ratio，Tfr cell ratio，Tfh/Tfr cell ratio，and the distribution of IL-21 in RA patients，and analyzed the correlation between ying-wei disharmony syndrome score，Tfh cell ratio，Tfr cell ratio，Tfh/Tfr cell ratio，IL-21，and other indicators.Results：The ying-wei disharmony syndrome score of RA patients was positively correlated with age，disease duration，erythrocyte sedimentation rate，immunoglobulin A，number of joint tenderness，health assessment questionnaire，and

28 joint disease activity index（P < 0.05）;the Tfh/Tfr cell ratio and IL-21 in RA patients were positively correlated with the ying-wei disharmony syndrome score（P < 0.05），while Tfr cells were negatively correlated with the ying-wei disharmony syndrome score（P < 0.05）.Conclusion：Ying-wei disharmony is the fundamental pathogenesis of the occurrence and development of rheumatoid arthritis，which affects the patient's condition.Ying-wei disharmony can correspond to the imbalance of Tfh/Tfr cells，and the balance of Tfh/Tfr cells may be a concrete manifestation of ying-wei harmony in modern theory.

【Keywords】 rheumatoid arthritis;the Ying-Wei Theory;ying-wei disharmony;Tfh cells;Tfr cells

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种抗原驱动、T细胞介导及遗传相关的全身性自身免疫病，主要表现为侵蚀性关节炎。RA全球患病率为0.5%～1%［1］，我国大陆患病率为0.42%，其中女性较男性更普遍［2］。现有研究表明，RA发生、发展过程中有多种免疫细胞参与，其中滤泡辅助性T细胞（Tfh）与滤泡调节性T细胞（Tfr）发挥着关键作用［3］。RA属中医学“痹证”“历节”“尫痹”等范畴。从中医学角度出发，营卫失和是RA发生的重要内因。本研究旨在探究RA营卫失调证候积分与Tfh细胞/Tfr细胞失衡的相关性，从营卫学说角度阐述Tfh/Tfr细胞失衡与RA中医病机之间的联系，为中医药补充治疗RA提供思路和依据，亦为RA的发病机制研究提供支持。

1 临床资料

1.1 一般资料 选取2021年9月至2022年12月在南京中医药大学附属中西医结合医院风湿免疫科就诊的门诊及住院RA患者62例，其中男7例，女55例；年龄23～81岁，平均（56.47±13.90）岁；病程1～480个月，平均34.50（12.00，120.00）个月；8例患者有RA家族史，10例患者未经治疗。本研究方案获得南京中医药大学附属中西医结合医院医学伦理委员会批准（伦理号2021LWKYZ035）。

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准 按照1987年美国风湿病学会（ACR）或2010年ACR/欧洲抗风湿病联盟（EULAR）发布的RA诊断标准［4］。

1.2.2 中医证候标准 按照《中药新药临床研究指导原则（试行）》［5］，结合古今RA辨证相关文献，经由课题组成员共同讨论，3位主任医师共同制定本研究营卫失调症状分级量化积分表。营卫失调证候主要症状包括肢冷畏寒、无汗、多汗、恶风、易感冒、发热、四肢不仁、不寐、痈肿，每项症状根据严重程度分为无、轻度、中度、重度4级，分别计为0、1、2、3分。总分最高27分。

1.3 纳入标准 ①符合上述诊断标准；②年龄18～85岁；③自愿签署知情同意书。

1.4 排除标准 ①合并病毒性脑膜炎、获得性免疫缺陷综合征、肝炎、结核等疾病者；②合并弥漫性毒性甲状腺肿、溃疡性结肠炎、银屑病、过敏性紫癜等其他自身免疫性疾病者；③合并严重糖尿病、心脑血管疾病、肝肾功能不全，以及血液系统疾病、恶性肿瘤等疾病者；④怀疑或确有酒精、药物滥用病史者；⑤根据研究者的判断，具有降低入组可能性或使入组复杂化的其他病变或情况者。

2 方 法

2.1 资料搜集方法 ①一般资料：姓名、年龄、性别、职业、婚姻、家族史、既往病史等；饮酒、吸烟、饮食偏嗜、居住环境情况。②病史资料：RA病程，药物使用情况。③体格检查：身高、腰围、体质量、脉搏、呼吸、体温、血压、类风湿结节，计算体质量指数。④收集患者就诊时的实验室指标资料：血常规、肝功能［谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、白蛋白、球蛋白、总胆红素、直接胆红素、γ-谷氨酰转肽酶、碱性磷酸酶］、肾功能（肌酐、尿酸、尿素氮）、血糖、超敏C反应蛋白（hs-CRP）、红细胞沉降率（ESR）、类风湿因子（RF）、免疫球蛋白（IgG、IgM、IgA）、抗环瓜氨酸肽抗体（抗CCP抗体）；⑤白细胞介素（IL）-21检测：收集患者空腹血清，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测IL-21水平，操作步骤严格按照试剂盒说明进行；⑥Tfh、Tfr细胞检测：用EDTA-K2抗凝管收集患者清晨空腹新鲜血样。全血红细胞裂解液离心至细胞变成白色，细胞悬液里加入CD4、CD3、趋化因子受体5

（CXCR5）抗体（CD185），37 ℃避光孵育30 min，然后加入500 μL固定液，孵育30 min，离心去上清，加入500 μL破膜液，孵育30 min，离心去上清，加入100 μL PBS，再加入叉头/翼状螺旋转录因子P3（FoxP3），37 ℃避光孵育30 min，加入400 μL PBS后用流式细胞仪检测细胞表型。CD3+CD4+CXCR5+FoxP3+的细胞定义为Tfr细胞，CD3+CD4+CXCR5+FoxP3-的细胞定义为Tfh细胞。⑦西医评价量表：视觉模拟评分法（VAS）评分、健康评估问卷（HAQ）评分、28个关节病情活动指数（DAS28）评分、关节功能分级。⑧营卫失调证候积分。

2.2 统计学方法 采用SPSS 25.0、Graph Pad Prism 9软件进行统计学分析、作图。计量资料符合正态分布或近似正态分布以表示；不符合正态分布以中位数和四分位数间距［M（P25，P75）］表示；符合正态分布的连续资料采用Pearson分析，等级资料采用Spearman分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 RA相关指标分布 RA患者ESR、hs-CRP、RF、抗CCP抗体、IgG、IgM、IgA、关节肿胀数、关节压痛数、VAS评分、HAQ评分、DAS28评分、关节功能分级情况见表1。

3.2 营卫失调证候积分、Tfh细胞比例、Tfr细胞比例、Tfh/Tfr细胞比值、IL-21分布 62例RA患者营卫失调证候积分（6.52±2.93）分，Tfh细胞比例7.03（3.54，15.21）%，Tfr细胞比例1.04（0.40，4.19）%，Tfh/Tfr细胞比值4.86（1.19，26.37），IL-21水平15.91（14.18，20.36）pg·mL-1。见图1。

3.3 营卫失调证候积分与RA指标的相关性 RA患者营卫失调证候积分与年龄、病程、ESR、IgA、关节压痛数、HAQ评分、DAS28评分呈正相关（P < 0.05）。见表2。

3.4 营卫失调证候积分与Tfh细胞比例、Tfr细胞比例、Tfh/Tfr细胞比值、IL-21的相关性 RA患者中，营卫失调证候积分与Tfh/Tfr细胞比值、IL-21呈正相关（P < 0.05），营卫失调证候积分与Tfr细胞比例呈负相关（P < 0.05）。见表3。

4 讨 论

RA属于自身免疫性疾病，遗传与环境因素共同作用于免疫系统，导致T细胞信号传递异常，免疫功能受损，以致自身免疫反应发生［6］。RA的基础病理为慢性滑膜炎。ZHOU等［7］证明，Tfh细胞是RA患者滑膜中的主要浸润免疫细胞，与记忆激活的CD4+ T细胞、参与RA早期发病的生物标志物颗粒酶A（GZMA）和发挥促炎作用的M1巨噬细胞呈正相关，并猜测GZMA-Tfh细胞可能参与了RA的早期发病。RA疾病活动度也与Tfh细胞相关。研究表明，疾病活动期的RA患者外周Tfh细胞比例高于稳定期RA患者与健康对照组，同时外周Tfh细胞比例也与抗CCP抗体、RF及DAS28评分呈正相关［8-9］。RA的发病也有Tfr细胞的参与，RA患者的Tfr细胞数量与IgG、RF、抗CCP抗体、DAS28评分呈负相关。随着RA患者的病情稳定缓解，循环Tfr细胞增加，抑制自身免疫，稳定病情［10］。

《灵枢·营卫生会篇》中记载营卫来源于水谷精微，属于人体的营养物质，“其轻者为营，浊者为卫”。营气在脉中循行，可以“荣四末”“内注五脏六腑”；卫气“行于四末、分肉、皮肤之间而不休”“熏于肓膜，散于胸腹”。营卫同源异质， 是抵御外邪的重要物质。RA属中医学“痹证”范畴，以关节肿痛、晨僵为主要临床表现，典型的发病部位包括手部关节、腕关节、膝关节以及足部关节，而关节附近的肌肉、软组织也会受影响。RA的发病病位与营卫的循行部位相合。《黄帝内经》中明确提出营卫不和是痹证发生的内因。营卫不和，正气耗损，抵御外邪无能，与“风寒湿气合”，痹阻关节、肌肉与经络，形成痹证。营卫失于调和是痹证从组织改变到病理损害的内在机理［11］。马运锋等［12］认为，营卫失和是RA整个发病过程中的内在依据，但早期外因为风寒湿热，内因是营卫不和；中期外因为风寒湿热深伏，内因是营虚卫弱、脏腑功能失调；晚期外因是风寒湿热与痰瘀胶结，内因为营卫俱微、脏腑虚损。本研究中，RA患者营卫失调证候积分与年龄、病程、ESR、IgA、关节压痛数、HAQ评分、DAS28呈正相关（P < 0.05），证明营卫失和是RA发生、发展的基本病机，贯穿RA发病的整个过程，影响患者病情。

从西医学的角度来看，营血可对应血液循环系统，卫气或相当于免疫系统，营卫循行可与免疫细胞在淋巴管、血管、组织间隙再到淋巴管的循环对应［11］。已有研究发现，调和营卫具有调节免疫的作用，调节营卫的代表方剂——桂枝汤、桂枝芍药知母汤可以影响CD4+ T细胞水平［13-15］。Tfh细胞与Tfr细胞影响彼此分化、共同发挥免疫作用与卫阳营阴的对立制约、互根互用相似，且都在RA发生、发展中表现为失衡则致病。同时本研究也发现，RA患者营卫失调证候积分与Tfh/Tfr细胞比值呈正相关（P < 0.05），与Tfr细胞比例呈负相关（P < 0.05），说明从中西医结合角度看待RA发病机制，营卫失调可与Tfh/Tfr细胞失衡对应，Tfh/Tfr细胞平衡可能属于营卫和调在现代理论下的具象体现。白芍总苷属于免疫调节药，是白芍的有效成分，可用于RA治疗。研究表明，白芍总苷可通过STAT3信号通路抑制Tfh细胞分化和GC形成［16］，还可以调节Th1/Th2、Th17/Treg细胞亚群平衡［17］。桂枝、白芍是调节营卫的经典药对，结合上述研究，提示调节营卫可能就是调节免疫系统稳态。但目前尚未发现桂枝提取物对Tfh或Tfr细胞有影响以及白芍提取物是否可作用于Tfr细胞分化，还需要进一步的研究验证这一经典药对对免疫系统稳态的影响。

本研究还观察到RA患者营卫失调证候积分与IL-21呈正相关（P < 0.05）。Tfh细胞产生IL-21，IL-21也可以自分泌方式促进Tfh细胞分化并诱导其自身表达［18］。IL-21还可以调节Tfh/Tfr平衡，对T、B细胞分化，抗体生成有着重大意义［19］。本研究已经得出Tfh/Tfr细胞比例与营卫失调证候积分相关，而IL-21与Tfh/Tfr稳态相关，故营卫失调证候积分与IL-21正相关符合预期结果。

本研究收集的样本量有限，所纳入的RA患者存在地域局限性，大部分患者处于疾病活动期，可能存在选择偏倚，拟下一步联合其他医院开展多中心研究，为中医学诊疗RA提供思路和依据，亦为RA的中西医发病机制研究提供支持。另外，本研究初步观察RA患者营卫失调与Tfh/Tfr细胞失衡的相关性，未设计健康对照组，存在年龄、性别、合并病等混杂因素，限制了结果的推广，下一步拟加入健康对照组验证营卫与Tfh/Tfr细胞之间的关系。此外，本研究证实RA患者营卫失调与Tfh/Tfr细胞失衡相关，营卫失调是RA发生、发展的内在依据。在此过程中，本研究未细分营卫失调是营卫不畅还是营卫有余还是营虚卫弱，下一步可基于本试验的结果，探寻不同RA患者营卫状态以及Tfh/Tfr细胞失衡与不同营卫状态的相关性，促进中医的免疫学研究，为中医的治法治则提供更多的思考角度。

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收稿日期：2024-01-24；修回日期：2024-03-08