基于网络药理学与分子对接方法探讨见血飞治疗类风湿关节炎的作用机制

【摘 要】目的：采用网络药理学和分子对接方法研究苗药见血飞干预类风湿关节炎作用机制，为基础研究及临床研究提供依据。方法：文献检索筛选见血飞的活性成分，通过Swiss ADME网站预测药物靶点，利用Genecards数据库、DisGeNet数据库、DRUGBANK数据库、OMIM数据库、MalaCard数据库及TTD数据库筛选类风湿关节炎相关靶点；采用CytoScape 3.8.2软件构建蛋白互作网络及活性成分-关键靶点-通路；使用R语言进行GO富集分析和KEGG通路富集分析；使用Molecular Operating Environment（MOE）进行分子对接。结果：预测TLR4、CASP3、PTGS2、MMP-9是见血飞干预类风湿关节炎的关键靶点；分子对接表明Decarine、飞龙掌血素、白屈菜红碱、二氢白屈菜红碱、珊瑚菜内酯、橙皮素、Oxychelerythrine和茵芋碱与TLR4、CASP3、PTGS2、MMP-9对接结合力平均值-5.92 kcal·mol-1。

结论：通过网络药理学和分子对接方法，初步揭示了见血飞干预类风湿关节炎的潜在机制。关键靶点包括TLR4、CASP3、PTGS2和MMP-9，进一步实验验证有望为见血飞的临床应用提供理论支持。

【关键词】 类风湿关节炎；见血飞；网络药理学；分子对接

Exploring the Mechanism of Jianxuefei in Treating Rheumatoid Arthritis Based on Network Pharmacology and Molecular Docking Method

ZHANG Yu-qing，YANG Bing，HUANG Xin-fu，MA Wu-kai，YANG Peng

【ABSTRACT】Objective：To investigate the mechanism of Miao medicine Jianxuefei（Root of Spinyleaf Pricklyash）in the intervention of rheumatoid arthritis（RA）using network pharmacology and molecular docking method，and provide a basis for basic and clinical research.Methods：Literature search was conducted to screen the active ingredients in Jianxuefei.Drug targets were predicted through the website Swiss ADME，and RA related targets were screened using databases Genecards，DisGeNet，DRUGBANK，OMIM，MalaCard，and TTD.Protein interaction network and active ingredient key target pathway was constructed using software CytoScape 3.8.2.GO enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis were performed using R language.Molecular Operating Environment（MOE）was used for molecular docking.Results：TLR4，CASP3，PTGS2，and MMP-9 were predicted to be key targets for the intervention of RA in the blood.Molecular docking showed that the average binding affinity of Decarine，Phellinin，Chelerythrine，DihydroChelerythrine，Coranolactone，Hesperetin，Oxychelerythrine，and Coloane to TLR4，CASP3，PTGS2，and MMP-9 was

-5.92 kcal·mol-1.Conclusion：Through network pharmacology and molecular docking method，the potential mechanism of Jianxuefei’s intervention in RA has been preliminarily revealed.The key targets include TLR4，CASP3，PTGS2，and MMP-9，and further experimental validation is expected to provide theoretical support for the clinical application of Jianxuefei.

【Keywords】 rheumatoid arthritis;Jianxuefei;network pharmacology;molecular docking

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种

以侵蚀性、对称性多关节炎为主要临床表现的慢性、全身性自身免疫性疾病［1］。其发病机制不明，但与遗传、免疫紊乱、环境等因素密切相关。治疗以非甾体抗炎药（NSAIDs）、改善病情抗风湿药（DMARDs）、生物制剂、糖皮质激素为主，但不良反应大，易引起肝肾损伤、溃疡、感染、心血管疾病等损害［2］。

苗药见血飞，又称飞龙掌血［Toddalia asiatica （L.）Lam.］，是芸香科、飞龙掌血属植物［3］，提取物具有抗关节炎、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种作用［4］。然而见血飞治疗RA的机制尚不清楚。已有研究表明，飞龙掌血的根皮提取物在多种体外和体内模型中表现出显著的抗肿瘤活性，并能通过多变量统计分析确定其药效物质基础［5］。另有研究表明，见血飞不仅在抗炎和抗肿瘤方面有显著效果，还具有止血和保肝作用，其机制已通过多种实验研究验证［6］。这些研究为本课题提供了科学依据。

网络药理学基于“疾病-基因-靶点-药物”相互作用网络，通过网络分析，系统综合观察药物对疾病网络的干预与影响，揭示多分子药物协同作用于人体的奥秘［7］。分子对接是通过化学计量学方法模拟分子的几何匹配和能量匹配，对于给定的蛋白质和配体（蛋白质、DNA/RNA、小分子），可以预测它们的结合模式及结合自由能，进而对其功能及作用机制进行研究［8-9］。

为了更好地分析苗药见血飞干预RA的作用机制，本研究借助网络药理学及分子对接，预测苗药见血飞的有效活性成分及其潜在作用靶点，为深入研究药效物质基础、作用机制以及临床应用提供一定的基础。

1 资料与方法

1.1 活性成分的筛选和靶点预测 通过查阅飞龙掌血化学成分信息文献查找化合物，将所得化合物结构图输入Swiss ADME平台（http：//www.swissadme.ch/）进行预测，以“homo sapiens”为选择物种，设置潜在核心化合物的标准为：①肠胃吸收（gatrointestinal absortion；GIabsortion）为“High”，表明成分具备良好口服生物利用度，可被吸收；②设置5类药性预测（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge），结果中有2个及2个以上为“Yes”［10-11］。获取潜在化合物的靶点，选择“Probability≥0.1”的靶点。

1.2 RA相关靶点筛选 以“rheumatoid arthritis”为关键词搜索DisGeNet数据库、OMIM数据库、GeneCards数据库、DRUGBANK数据库、MalaCard数据库以及TTD数据库，获得RA核心基因靶点。其中DisGeNet数据库获取的基因靶点，选择“Score_gda≥0.1”的靶点，而GeneCards数据库选择“Relevance score（相关系数）≥0.1”的靶点基因。合并上述数据库获得的RA相关疾病靶点并删除重复值。

1.3 活性成分靶点与疾病靶点的筛选 RA疾病基因靶点与药物相关靶点进行整合，导入R软件输入药物靶点、疾病靶点，两者取交集后获得“活性成分-疾病共同靶点”，并制作韦恩图。

1.4 蛋白相互作用（PPI）网络的构建和核心靶点的筛选 将“药物-疾病共同靶点”导入STRING 11.0数据库（https：//string-db.org/），以“homo sapiens”为选择物种，最小互作阈值设定为“highest confidence（最高置信度） > 0.9”，其余为默认设置，以获得PPI网络关系，并通过Cyto Scape 3.8.2软件制作PPI网络图，使用“Analysis Network”工具得到PPI网络之间的相关参数。基于“Degree（度值）”“Betweennesss centrality（间性中心性）”“Closenessss centrality（亲和中心性）”对PPI网络进行拓扑分析，根据网络拓扑学参数判断RA核心靶点。

1.5 GO富集分析和KEGG通路富集分析 将“药物-疾病共同靶点”导入R语言，使用ClsuterProfiler程序包，得出GO富集分析和KEGG富集通路分析。其中GO富集分析中包含生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）3个模块。

1.6 “活性成分-关键靶点-通路”网络的构建 将“药物-疾病共同靶点”与见血飞潜在活性成分、关键靶点和KGEE富集通路导入Cytoscape 3.8.2软件，绘制“活性成分-关键靶点-通路”网络。

1.7 分子对接验证 将筛选出的“潜在活性成分”与“核心靶点”进行分子对接验证。“核心靶点”通过RCSB数据库（https：//www.rcsb.org/pdb）下载靶点蛋白的3D结构，使用MOE 2019软件去除水分子及自带配体，使用QuickPrep对蛋白进行加氢、质子化等。“核心成分”从PubChem数据库（https：//pubchem.nc-bi.nlm.nih.gov/）下载活性成分的小分子配体2D结构，使用MOE 2019进行能量最小化。最后进行分子对接，并计算对接结果的结合能。

2 结 果

2.1 见血飞成分筛选及靶点 通过文献［12-17］获取参与实验研究的药物成分，合并剔除重复成分后得到13个药物成分，经SwissADME平台筛选出符合要求的8个活性成分，其中包括Decarine、飞龙掌血素、白屈菜红碱、二氢白屈菜红碱、茵芋碱等，见表1。同时Swiss-Target Prediction平台预测，选取符合要求的靶点后去重得到365个靶点。

2.2 RA相关靶点 在Genecards数据库中得到RA相关作用靶点4956个，选择相关度得分≥10的靶点作为RA的潜在靶点，获得361个相关靶点。结合DisGeNet数据库、DRUGBANK数据库、OMIM数据库、MalaCard数据库及TTD数据库，去重后合并，最终得到555个RA潜在靶点。将“2.1”项筛选出的365个靶点与555个RA潜在靶点，导入EVenn网站，得到73个共同靶点，即“药物-疾病共同靶点”，并通过EVenn网站绘制韦恩图，见图１。

2.3 PPI网络 将“2.2”项得出的“药物-疾病共同靶点”的73个靶点，通过STRING 11.0数据库，构建PPI网络后导入CytoScape 3.8.2软件进行可视化处理，见图2。其中节点表示靶基因，边表示靶基因间的相互作用关系。该网络中涉及72个节点，936条边。使用CytoScape 3.8.2软件中的“Analysis Network”工具得出度值、间性中心性、亲和中心性排前4的核心基因，见表2，分别为TLR4、CASP3、PTGS2、MMP-9，提示作为核心基因在治疗RA过程中发挥重要作用。

2.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析 将“2.2”项得出的“药物-疾病共同靶点”73个靶点，导入R语言进行见血飞药物成分干预RA靶点的GO富集分析（见图３）和KEGG通路富集分析（见图4），可见主要涉及生物学过程的有：对细胞因子产生的积极调节、对类固醇激素的反应、胶原蛋白分解过程等。KEGG通路富集分析结果显示，其中主要涉及脂质和动脉粥样硬化、PI3K-AKT信号传导通路、卡波西肉瘤相关的通路等。

2.5 活性成分-关键靶点-通路网络 活性成分-关键靶点-通路网络图中共有101个节点，其中见血飞8个药物成分，“药物-疾病共同靶点”中的73个靶点与KEGG富集出的20个通路，三者导入Cytoscape 3.8.2软件，构建“活性成分-关键靶点-通路”网络，见图5。结果显示，见血飞的8个药物成分可调控多个关键靶蛋白，作用于多条通路发挥干预RA的作用。

2.6 分子对接 将“2.2”项得出的8种核心潜在化合物，即Decarine、飞龙掌血素、白屈菜红碱等，与“2.4”项得出4个核心靶点TLR4、CASP3、PTGS2、MMP-9分别进行分子对接。当Affinity < 0 kcal·mol-1时，认为分子蛋白质自发结合并相互作用，而且结合能越低，分子构象越稳定，Affinity < -5 kcal·mol-1，表明对接结合力较好［18］。

其中对接最高Affinity值为PYGS2-飞龙掌血素，值为-7.26 kcal·mol-1，而最低Affinity值为MMP-9-茵芋碱值，值为-4.69 kcal·mol-1，对接结合力平均值为-5.92 kcal·mol-1，提示整体对接结合力较好，见图6。其中部分核心靶点与药物成分部分分子对接可视化结果，见图7。

3 讨 论

本研究应用网络药理学方法，预测苗药见血飞治疗RA潜在核心成分及核心靶点，从“活性成分-关键靶点-通路”将8种药物成分作为潜在核心成分。其中飞龙掌血素在脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞RAW264细胞模型中抑制的p38和细胞外信号调节激酶（ERK）1/2的磷酸化和核转录因子-κB（NF-κB）的激活，并且能够抑制炎症因子mRNA的表达和一氧化氮的产生［19］，同时飞龙掌血素在250 μmol·L-1可诱导U-937细胞的凋亡，涉及ERK和蛋白激酶B（AKT）的磷酸化水平下降［20］。白屈菜红碱在飞龙掌血根的乙酸乙酯部位中含量最高，且白屈菜红碱具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗纤维化等作用，其中白屈菜红碱抗肿瘤作用涉及抑制蛋白激酶C（PKC）的活性、促凋亡的信号通路等［14］。二氢白屈菜红碱及Decarine对人肺癌细胞H1299-EGFP的生长有显著的抑制作用［16］。飞龙掌血醇提物可降低佐剂性关节炎大鼠血清和关节滑膜组织中白细胞介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、前列腺素E2含量，并且提示重建促炎和抗炎细胞因子的平衡，可能是其治疗RA的机制之一［21］。尽管本研究主要依赖于网络药理学和分子对接的方法，缺乏实验验证，但通过文献综述和已有研究的支持，见血飞在抗炎和抗肿瘤方面的潜力得到了初步确认。未来的研究应注重实验验证，以进一步巩固和扩展这些发现，特别是在细胞实验和动物模型中检验见血飞的实际疗效和作用机制。此外，临床研究也应被纳入考量，以确定见血飞在RA患者中的实际应用效果和安全性。

KEGG富集通路提示PI3K-AKT信号通路，而PI3K-AKT信号通路是重要的细胞内信号转导通路，此通路与RA成纤维样滑膜细胞（FLS）凋亡异常密切相关，抑制异常活化的PI3K-AKT信号通路可以诱导RA-FLS凋亡，对RA有治疗作用［22］。以见血飞为组成的苗药“四大血”对胶原诱导性关节炎大鼠滑膜血管增生研究提示，四大血可抑制AKT的磷酸化水平，并且缓解滑膜血管新生和炎症，从而发挥治疗作用［23］。进一步预测见血飞调节PI3K-AKT信号通路干预RA。

在PPI网络中，排名前4的核心基因为TLR4、CASP3、PTGS2、MMP-9。TLR4与RA滑膜炎症联系最为密切，可诱导NF-κB活化，进而上调IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子的表达，促进免疫炎症反应［24］，并且NF-κB通路参与免疫细胞的转移以及骨吸收，与RA的病理发展进程密切相关［25］。

CASP3是细胞凋亡的关键参与者，细胞凋亡过程中CASP3转化为活化形式的半C-CASP3才能执行细胞最终凋亡程序。有研究提示，飞龙掌血醇提物组对人非小细胞肺癌细胞系A549细胞中C-CASP3的蛋白表达量增加［26］。PTGS2又名环氧化酶2（COX-2），其催化花生四烯酸生成前列腺素，从而加剧炎症反应和组织损伤。COX-2抑制剂，如塞来昔布，已被广泛应用于临床，以缓解RA引起的关节肿痛。MMP-9又称明胶酶B，属于基质金属蛋白酶家族，在软骨降解以及骨破坏中发挥重要作用，可释放生物活性形式的血管内皮生长因子，并对血管基底膜蛋白有直接的蛋白水解作用［27］。并且有研究提示，RA合并间质性肺病中MMP-9与病情严重程度密切相关［28］，检测其水平有助于临床诊治，同时可以用于判断预后。

本研究采用网络药理学方法分析苗药见血飞治疗RA的作用机制，预测见血飞治疗RA的有效成分及其关键靶点、作用通路，体现了多成分、多靶点、多通路的作用特点，同时以分子对接对核心成分与核心靶点进行检验，其结果平均分为-5.92 kcal·mol-1，提示两者对接结合力较好，更一步为见血飞治疗RA的深入研究提供参考依据。

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收稿日期：2024-04-06；修回日期：2024-05-20