转导蛋白β样1 X连接受体1表达对卵巢癌A2780细胞增殖和迁移的影响

［摘要］ 目的： 研究转导蛋白β样1 X连接受体1（transducin beta-like 1 X-linked receptor，TBL1XR1）在卵巢癌患者组织中表达，及其对卵巢癌A2780细胞增殖和迁移的影响。方法： 采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测10对卵巢癌组织、癌旁组织中及人卵巢癌IOSE80、A2780、CP70、SKOV-3中TBL1XR1 mRNA表达，筛选TBL1XR1 mRNA高表达细胞株。选择4～6周龄雌性BALB/C裸鼠，建立卵巢癌人源肿瘤异种移植（patient-derived tumor xenografts，PDTX）模型；将10只模型鼠均分为siR-NC组和si-TBL1XR1组，每组5只，分别给予siR-NC、si-TBL1XR1局部注射，10 mg/kg，每3 d注射1次，18 d后取各组瘤组织，计算其体积与重量。取卵巢癌A2780细胞，将其分为siR-NC组、si-TBL1XR1组、pcDNA3.1组和pcDNA3.1-TBL1XR1组，分别予以siR-NC、si-TBL1XR1、pcDNA3.1空载质粒和pcDNA3.1-TBL1XR1质粒处理；采用蛋白免疫印迹法检测各组卵巢癌细胞周期蛋白表达，MTT比色法检测细胞活力，流式细胞术检测细胞周期和凋亡细胞比例，以及Transwell细胞迁移实验检测细胞迁移能力。结果： 卵巢癌组织中TBL1XR1 mRNA表达明显高于癌旁组织（Plt;0.05）；人卵巢癌A2780细胞系TBL1XR1 mRNA表达明显高于卵巢癌IOSE80、CP70、SKOV-3细胞系（Plt;0.05）。与siR-NC组相比，第18天si-TBL1XR1组瘤体积明显减小（Plt;0.05），重量明显降低（Plt;0.05）。与siR-NC组相比，si-TBL1XR1组促癌细胞周期蛋白表达明显降低（Plt;0.05），与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-TBL1XR1组表达则明显升高（Plt;0.05）；与siR-NC组相比，si-TBL1XR1组卵巢癌细胞迁移数明显降低（Plt;0.05），早期凋亡和晚期凋亡细胞比例明显升高（Plt;0.05）；与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-TBL1XR1组卵巢癌细胞迁移数明显增多（Plt;0.05），早期凋亡和晚期凋亡细胞比例明显降低（Plt;0.05）。结论： TBL1XR1在卵巢癌组织中呈高表达，降低TBL1XR1 mRNA表达可抑制卵巢癌A2780细胞增殖和迁移。

［关键词］ 卵巢癌；转导蛋白β样1 X连接受体1（TBL1XR1）；人源肿瘤异种移植模型；细胞周期

［中图分类号］ R737.31" ［文献标志码］ A" ［文章编号］ 1671-7783（2024）04-0331-07

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y230090

［引用格式］褚秀，金蔚. 转导蛋白β样1 X连接受体1表达对卵巢癌A2780细胞增殖和迁移的影响［J］. 江苏大学学报（医学版）， 2024， 34（4）： 331-337.

［基金项目］常熟市卫生和计划生育委员会科技计划立项项目（csws201801）；常熟市科技局立项项目（20170016）

［作者简介］褚秀（1997—），女，硕士研究生；金蔚（通讯作者），主任医师；E-mail： jinweichsh@126.com

Effect of the expression of transducer protein β-like 1 X linked receptor 1 on proliferation and migration of ovarian cancer A2780 cells

CHU Xiu JIN Wei2

（1. School of Medicine， Jiangsu University， Zhenjiang Jiangsu 212013; 2. Department of Obstetrics and Gynecology， Changshu Second People′s Hospital， Changshu Jiangsu 215500， China）

［Abstract］ Objective： To investigate the expression of transducer protein β-like 1 X linked receptor 1 （TBL1XR1） in the tissues of ovarian cancer patients and its effect on the proliferation and migration of ovarian cancer A2780 cells. Methods： Real-time quantitative fluorescent PCR （qRT-PCR） was used to detect the expression of TBL1XR1 mRNA in 10 pairs of ovarian cancer tissues and adjacent tissues， and IOSE80， A2780， CP70 and SKOV-3 human ovarian cancer cell lines， the latter was used to screen the cell lines with high expression of TBL1XR1 mRNA. BALB/C nude mice aged 4-6 weeks were selected to establish patient-derived tumor xenografts （PDTX） model. Ten PDTX model mice were divided into siR-NC group and si-TBL1XR1 group， with 5 mice in each group; siR-NC and si-TBL1XR1 were given via local injection， respectively， 10 mg/kg， once every 3 days. After 18 days， cancer tissues were harvested from each group， and their volume and weight were calculated. Ovarian cancer A2780 cells were taken and divided into siR-NC group， si-TBL1XR1 group， pcDNA3.1 group and PCDNA3.1-TBL1XR1 group; and they were treated with siR-NC， si-TBL1XR empty vector plasmid pcDNA3.1 and PCDNA3.1-TBL1XR1 plasmid， respectively. The expression of cyclin in ovarian cancer cells in each group was detected by Western blotting， the cell viability was detected by MTT， the cell cycle and the proportion of apoptotic cells were detected by flow cytometry， and the cell migration ability was detected by Transwell assay. Results： The expression of TBL1XR1 mRNA in ovarian cancer tissues was significantly higher than that in adjacent tissues （Plt;0.05）， and the expression of TBL1XR1 mRNA in human ovarian cancer A2780 cell line was significantly higher than that in IOSE80， CP70 and SKOV-3 cell lines （Plt;0.05）. Compared with siR-NC group， the tumor volume and weight of si-TBL1XR1 group were significantly decreased on the 18th day （both Plt;0.05）. Compared with the siR-NC group， the expression of cyclin in si-TBL1XR1 group was significantly decreased （Plt;0.05）， while the expression in PCDNA3.1-TBL1XR1 group was significantly increased compared with pcDNA3.1 group （Plt;0.05）. Compared with siR-NC group， the number of ovarian cancer cell migration in si-TBL1XR1 group was greatly decreased （Plt;0.05）， and the proportion of early and late apoptotic cells was markedly increased （Plt;0.05）; and compared with pcDNA3.1 group， the migration number of ovarian cancer cells in pcDNA3.1-TBL1XR1 group was significantly increased （Plt;0.05）， and the proportion of early apoptotic and late apoptotic cells was greatly decreased （Plt;0.05）. Conclusion： TBL1XR1 is highly expressed in ovarian cancer tissues， and reducing TBL1XR1 mRNA expression could significantly inhibit the proliferation and migration of ovarian cancer A2780 cells.

［Key words］ ovarian cancer; transducer protein β-like 1 X linked receptor 1 （TBL1XR1）; patient-derived tumor xenografts models; cell cycle

卵巢癌是妇科恶性肿瘤患者死亡的主要原因之一，其中上皮性卵巢癌占80%～90%，全球5年生存率低于30%［1］。卵巢癌患者预后差［2-3］，目前虽然晚期和转移性卵巢癌的靶向治疗已取得一些进步，但效果有限。

转导蛋白β样1 X连接受体1（transducin beta-like 1 X-linked receptor，TBL1XR1）是含有F-box/WD40-重复的蛋白质［4］，参与转录调控，在调控基因抑制和激活之间的精确转换中起重要作用［5-8］，并且影响肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移［9-10］。本课题组前期研究表明，TBL1XR1 mRNA在卵巢癌组织中的表达明显高于癌旁组织，且TBL1XR1 mRNA表达水平越高，则卵巢癌患者总生存率和无病生存率越低［11］。因此，本研究拟通过建立人源肿瘤异种移植（patient-derived tumor xenografts，PDTX）模型，探究以TBL1XR1基因作为目标靶的药物对卵巢癌细胞增殖和迁移的影响。

1 材料和方法

1.1 卵巢癌组织来源及实验动物、细胞和主要试剂

选择2021年1月至2021年12月于常熟市第二人民医院妇产科行R0切除术的患者10例，入选标准为卵巢恶性肿瘤诊断与治疗指南（2021年版）［12］。分别取其卵巢癌组织和癌旁组织（距离病灶2 cm的组织），置入RPMI 1640培养基中（含20%胎牛血清和0.05%链霉素）。所有标本提供者均签署知情同意书。

4～6周龄雌性BALB/C裸鼠48只，体重（20±2）g，购自南京大学南京生物医药研究院，饲养于SPF级动物房（25±2）℃，40%～70%湿度，12 h∶12 h昼夜交替，自由饮食。PDTX模型鼠的饲养、肿瘤移植和传代方法及观测指标参照文献［13］。

人卵巢癌IOSE80、A2780、CP70和SKOV-3细胞株均购自中国科学院上海生命研究所。pc DNA3.1（+）空载质粒、pcDNA3.1-TBL1XR1质粒、蛋白酶抑制剂、免疫印迹化学发光试剂ECL购自美国Thermo公司；siR-NC和si-TBL1XR1由江苏吉玛生物公司构建并合成；RIPA裂解液、Trizol试剂、MTT及结晶紫染色液购自上海碧云天生物技术有限公司。兔抗人TBL1XR1、细胞周期蛋白D1（cyclinD1）、细胞周期蛋白E2（cyclinE2）、p21、细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）、GAPDH单克隆抗体以及抗兔IgG二抗购自英国Abcam公司。青霉素链霉素溶液（双抗）购自武汉尚恩生物技术有限公司；RPMI 1640培养基及胎牛血清购自美国Gibco公司；RNA反转录试剂盒、SYBR-Green PCR Master Mix购自美国Applied Biosystems公司；PVDF膜购自美国Bio-Rad公司；甲臜溶解液购自上海瑞奇生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 qRT-PCR检测人卵巢癌组织和癌旁组织中TBL1XR1 mRNA表达 Trizol试剂盒提取总RNA，反转录试剂盒转录成cDNA，SYBR Green PCR Master Mix试剂盒行qRT-PCR。TBL1XR1上游引物：5′-GGGCCTTTATGCTGCCCTAA-3′，下游引物：5′-TTC-ATTCTCTTCTGTACCTGGGA-3′；GAPDH上游引物：5′-GCAACTAGGATGGTGTGGCT-3′；下游引物：5′-TC-CCATTCCCCAGCTCTCATA-3′。以GAPDH为内参。

20 μL qRT-PCR体系：2 μL cDNA，10 μL 2×SYBR Green PCR Master Mix，上、下游引物各0.4 μL，7.2 μL蒸馏水；反应步骤：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸40 s，共40个循环。以2-ΔΔCt表示目的基因相对表达量。

1.2.2 qRT-PCR检测各细胞株中TBL1XR1 mRNA表达 具体实验方法同“1.2.1”。取TBL1XR1 mRNA相对表达量最高的细胞株进行后续细胞实验。

1.3 模型实验

1.3.1 卵巢癌PDTX模型构建及分组 取4～6周龄裸鼠饲养于SPF级环境中。选择卵巢癌手术切除2 h内肿瘤活力较好的组织样本，在含有1%双抗的培养基中将肿瘤组织剪成约2 mm×2 mm×2 mm小块。裸鼠行异氟醚麻醉后，将套管针刺入背部皮下，快速注入肿瘤组织，移植完成后缝合切口，每3 d测量小鼠皮下移植瘤体积。待移植瘤长至1 000～1 500 mm3，可进行传代。荷瘤裸鼠脱臼处死后，将裸鼠置于75%乙醇中浸泡2 min，获取肿瘤组织后，接种方法如上所述。传至第3代肿瘤能够稳定生长且成瘤率大于80%则表明建模成功。将建模成功后的第3～7代的10只荷瘤模型鼠随机分为2组：siR-NC组和si-TBL1XR1组，每组5只，按照组别分别给予siR-NC、si-TBL1XR1肿瘤局部周围注射，10 mg/kg，每3 d注射1次；治疗18 d后，处死小鼠，取各组移植瘤。

1.3.2 记录移植瘤体积变化和重量 每3 d测量1次小鼠肿瘤体积，18 d后测量小鼠移植瘤重量和体积。

1.4 细胞实验

1.4.1 细胞分组 取卵巢癌A2780细胞，将其分为siR-NC组、si-TBL1XR1组、pcDNA3.1组和pcDNA3.1-TBL1XR1组，分别予以siR-NC、si-TBL1XR1、pcDNA3.1空载质粒和pcDNA3.1-TBL1XR1质粒处理。

1.4.2 蛋白免疫印迹检测卵巢癌细胞周期蛋白表达水平 在RIPA裂解液中滴入适量的PMSF，低温混匀，配制好细胞裂解液。取“1.4.1”4组卵巢癌A2780细胞，6孔板每孔细胞加入250 μL配置好的细胞裂解液，低温反应裂解30 min；4 ℃，12 000 r/min离心5 min取上清液；加入上样缓冲液静置1 h，获得实验蛋白样品；采用紫外分光光度计评估蛋白浓度；BCA法测定蛋白浓度；行10% SDS-PAGE，70 V电泳30 min，110 V电泳60 min；350 mA转膜110 min，将蛋白转移至PVDF膜；5%脱脂奶粉室温封闭2 h；加入TBL1XR1、cyclinD1、p21、cyclinE2、CDK4和GAPDH一抗（稀释比均1∶3 000），4 ℃孵育过夜；TBST洗膜3次，加入抗兔IgG二抗（稀释比为1∶10 000），室温孵育2 h；TBST洗膜；ECL发光液显影，Image J拍照并分析。实验重复3次。

1.4.3 MTT比色法检测卵巢癌细胞增殖率 取孵育24 h后的4组卵巢癌对数生长期细胞于培养板中，每孔加入100 μL MTT溶液，孵育4 h；加入100 μL甲臜产物溶解液继续孵育，直至在普通光学显微镜下观察发现甲臜产物全部溶解。酶联免疫检测仪记录24、48、72 h时570 nm处光密度（D）值。每组重复3次。

1.4.4 流式细胞术检测细胞凋亡率、细胞周期的改变 取“1.4.1”4组A2780细胞，胰酶消化，收集细胞，PBS洗涤2次；75%乙醇固定过夜；4 ℃行1 000 r/min离心10 min，弃上清液；PBS洗净残留乙醇；加入PI对细胞进行染色，4 ℃避光孵育30 min；流式细胞仪检测分析。

1.4.5 Transwell检测卵巢癌A2780细胞迁移能力的改变 取1×104个各组卵巢癌A2780细胞，用无血清培养基稀释至200 μL，接种于铺有或无magtrigel的上室中。Transwell板中加入含10%胎牛血清的DMEM，然后将Transwell小室放入板中，并在小室中加入细胞悬液，孵育24 h；多聚甲醛固定细胞30 min；结晶紫染色30 min；PBS冲洗后常温干燥。光镜下拍照，每个Transwell小室随机选10个视野光镜下拍照，取迁移细胞数平均值进行统计。

1.5 统计学分析

作图、数据分析分别采用GraphPad Prism 7.0和SPSS 26.0统计软件。计量资料用均数±标准差（x±s）表示，若数据符合正态分布，则两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；若数据不符合正态分布，则用非参数检验，两组间比较用Kruskal-Wallis检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TBL1XR1 mRNA在人卵巢癌组织中呈高表达

qRT-PCR结果显示，卵巢癌组织中TBL1XR1 mRNA相对表达量明显高于癌旁组织（H=6.81，Plt;0.05）。见图1。

2.2 TBL1XR1 mRNA在卵巢癌A2780细胞株中高表达

qRT-PCR结果显示（图2），TBL1XR1 mRNA在卵巢癌A2780细胞株中相对表达量显著高于卵巢癌IOSE80、CP70、SKOV-3细胞株（t分别为3.79，3.09，2.29，P均＜0.01）。因此，选取卵巢癌A2780细胞株进行后续实验。

2.3 si-TBL1XR1干预抑制卵巢肿瘤生长

由图3可见，si-TBL1XR1组小鼠瘤体在干预第12天后体积逐渐变小，而siR-NC组瘤体则继续增长；其中，与siR-NC组相比，第3、6、9、12、15天，si-TBL1XR1组肿瘤体积差异无统计学意义（P＞0.05），第18天肿瘤体积明显减小（t=2.43，P＜0.05），小鼠肿瘤瘤体重量明显降低（t=3.37，P＜0.05）。

2.4 卵巢癌A2780细胞中相关细胞周期蛋白的表达

结果显示，与siR-NC组相比，si-TBL1XR1组卵巢癌A2780细胞中TBL1XR1、CDK4、cyclinD1和cyclinE2蛋白相对表达水平明显降低（t分别为3.17，2.19，-3.29，3.86，P均lt;0.05），p21蛋白相对表达水平明显升高（t=4.67，Plt;0.05）；与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-TBL1XR1组TBL1XR1、CDK4、cyclinD1和cyclinE2蛋白相对表达水平明显升高（t分别为2.17，4.01，3.11，4.15，P均lt;0.05），p21蛋白相对表达水平明显降低（t=4.56，Plt;0.01）。见图4。

2.5 si-TBL1XR1干预抑制卵巢癌A2780细胞增殖

结果显示（图5），与siR-NC组相比，72 h时si-TBL1XR1组卵巢癌A2780细胞D（570 nm）值明显降低（t=2.35，Plt;0.05），即si-TBL1XR1组细胞活力较弱；与pcDNA3.1组相比，72 h时pcDNA3.1-TBL1XR1组卵巢癌A2780细胞D（570 nm）值明显增高（t=1.78，P＜0.05），即pcDNA3.1-TBL1XR1组细胞活力较强。

2.6 卵巢癌A2780细胞凋亡、细胞周期的改变

流式细胞术检测结果显示（图6），与siR-NC组相比，si-TBL1XR1组卵巢癌A2780细胞S期细胞比例明显降低（t=1.13，P＜0.05），早期凋亡和晚期凋亡比例显著增高（t=4.41、5.17，P均lt;0.05）；与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-TBL1XR1组卵巢癌A2780细胞S期细胞比例明显增高（t=2.64，P＜0.05），早期凋亡和晚期凋亡比例明显降低（t=3.13、1.43，P均lt;0.05）。

2.7 si-TBL1XR1抑制卵巢癌A2780细胞迁移

Transwell迁移实验显示，与siR-NC组相比，24 h后si-TBL1XR1组卵巢癌A2780细胞迁移数明显减少（t=2.89，Plt;0.05）；与pcDNA3.1组相比，而pcDNA3.1-TBL1XR1组卵巢癌A2780细胞迁移数显著增多（t=3.67，Plt;0.05）。见图7。

3 讨论

TBL1XR1作为TBL1家族的一员，其在人原发性肺鳞状细胞癌、宫颈癌、乳腺癌和结肠癌中表达上调［14-15］，表明TBL1XR1可能在肿瘤进展中发挥重要作用。本研究结果显示，TBL1XR1 mRNA在卵巢癌组织中的表达明显高于癌旁组织，与既往研究结果相符，由此肯定了TBL1XR1基因作为卵巢癌靶向治疗靶点的合理性。为验证该想法，本实验建立PDTX模型，并通过肿瘤皮下异种移植建模。皮下异种移植操作简单，移植效率高，对于成瘤后的肿瘤便于观察，但由于皮下缺乏血管，不能及时给予肿瘤组织足够的营养，因此只适用于高度恶性的肿瘤，且成瘤率不高，本研究卵巢癌荷瘤鼠建模成功率仅为41.7%。有研究通过建立PDTX模型研究卵巢癌一线化疗方案的有效性，结果表明用紫杉醇+铂类7 d后即出现肿瘤生长明显抑制［16］。本研究采用si-TBL1XR1干预12 d后平均肿瘤体积出现下降趋势，18 d si-TBL1XR1组肿瘤体积较siR-NC组明显缩小。相较于目前卵巢癌的一线化疗方案而言，si-TBL1XR1抑瘤速度并无优越性，但本研究体现出针对TBL1XR1 mRNA的干预有明确的抑瘤效果，且靶向治疗针对性强，治疗精准，毒副反应小［17］。由此表明，可以考虑将si-TBL1XR1与其他化疗药物联合应用，以获得更高性价比的治疗效果。

cyclinD1是细胞周期调节中重要的调控因子，与CDK4结合对细胞周期进行正调控［18-19］，而cyclinE过表达可促进细胞快速进入S期，细胞恶性增殖，导致肿瘤发生［20］。p21既可作为肿瘤抑制基因又可作为细胞凋亡的抑制剂［21］。本研究结果显示，降低TBL1XR1表达可致CDK4、cyclinD1、cyclinE2等及相关细胞周期蛋白相对表达水平降低，p21蛋白表达升高，S期细胞比例增加，出现细胞周期S期停滞，TBL1XR1过表达则相反。在细胞周期中，G0/G1期细胞开始合成RNA和蛋白质，S期是DNA复制和合成的重要阶段。S期停滞导致DNA复制、有丝分裂、细胞生长和增殖失败，肿瘤生长停滞甚至倒退。TBL1XR1表达降低导致S期停滞且TBL1XR1与其他细胞周期蛋白密切关联、相互影响［22］。此外，本实验结果表明，TBL1XR1低表达则肿瘤细胞相对活性明显降低，即降低TBL1XR1表达可以使肿瘤细胞生长停滞，从而抑制卵巢癌发展，这可能与其影响肿瘤微环境、促进炎症和沉默信号通路等［17］相关，但具体机制有待进一步研究。

研究表明，卵巢癌铂类化疗的耐药机制主要包括逃避细胞凋亡、基因突变及其他外部因素等［23］。细胞早期凋亡时出现脂膜内侧外翻、线粒体膜电位下降，而在凋亡晚期，染色体DNA会发生断裂，且凋亡一旦发生则不可停止。选择性抑制Bcl-2蛋白家族成员的抗凋亡作用是肿瘤治疗的重要手段［24］。本研究发现，降低TBL1XR1 mRNA可促进卵巢癌A2780细胞凋亡，即可以选择性抑制TBL1XR1 mRNA表达作为抗卵巢癌的新的治疗手段，具体有待后续进一步研究。

本研究以TBL1XR1为切入点，建立了可用于实验的卵巢癌PDTX模型。结果表明，TBL1XR1 mRNA在卵巢癌组织中呈高表达，降低TBL1XR1 mRNA和蛋白表达可抑制卵巢癌A2780细胞增殖和迁移，促进其早期凋亡。

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［收稿日期］ 2023-03-27" ［编辑］ 刘星星