大白菜根肿病抗感品种间的侵染过程及生理生化差异分析

苏贺楠，秦六月，杨双娟，魏小春，赵艳艳，王志勇，张文静，张晓伟，原玉香

摘    要：根肿病是由芸薹根肿菌专性侵染十字花科蔬菜作物引起的一种世界性土传病害，对大白菜等蔬菜造成了严重的经济损失。以抗根肿病大白菜DH系（DH40R）和感病大白菜DH系（DH199S）为试验材料，通过观察根肿菌侵染的差异、防御酶活性、MDA和可溶性蛋白含量的测定研究大白菜根肿病抗性机制。结果表明，DH40R和DH199S的根毛侵染发生在接种后第2天，随着侵染时间的延长，出现皮层侵染，但DH40R的皮层侵染在接菌第8天后被阻断，对根肿病具有完全的抗性，而DH199S在接菌8 d后，根部有肿瘤产生。在接菌后2、8和13 d，分别对抗、感材料接菌和未接菌根部的防御酶活性、MDA和可溶性蛋白含量进行测定，发现DH40R在这3个时间点接菌后SOD的活性均显著高于未接菌对照组，在第8天达到最高峰值，显著高于DH199S；DH40R接菌后的CAT活性在第8 天达到最高峰值1 572.68 μmol·mL-1·min-1，显著高于DH40R未接菌对照组和接菌及未接菌处理的DH199S；在接菌后8和13 d，抗根肿病大白菜DH系DH40R的MDA含量显著低于接菌后的感病DH系DH199S；接菌后DH40R的可溶性蛋白含量在接菌后8 和13 d均显著高于DH199S。研究结果可为后期解析大白菜根肿病抗性相关机制的研究奠定基础。

关键词：大白菜；根肿病；侵染过程；生理生化指标

中图分类号：S634.1 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）06-045-07

Infection process and physiological and biochemical difference between clubroot-resistant and-susceptible Chinese cabbage lines

SU Henan， QIN Liuyue， YANG Shuangjuan， WEI Xiaochun， ZHAO Yanyan， WANG Zhiyong， ZHANG Wenjing， ZHANG Xiaowei， YUAN Yuxiang

（Institute of Vegetables， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： Clubroot is a worldwide soil-borne disease of the cruciferous plants caused by Plasmodiophora brassicae， leading to serious economic losses to cabbage and other Brassica crops. In order to clarify the clubroot resistance mechanism of Brassica rapa， this study was conducted to detect the differences of infection process， defense enzyme activity and the content of MDA and soluble protein between clubroot-resistant （DH40R） and clubroot-susceptible（DH199S）Chinese cabbage lines. The results showed that the primary （root hair infection） stage was at 2 day after inoculation（dai）in both clubroot-resistant （DH40R） and clubroot-susceptible （DH199S） Chinese cabbage lines. With the extension of the infection time， cortical infection was blocked and showed complete P. brassicae resistance in DH40R， while in DH199S， swollen root occurred in the root after 8 dai. The defense enzyme activity and the content of MDA and soluble protein were measured at 2， 8 and 13 dai. The activity of SOD in DH40R after inoculation is significantly higher than the mock at the whole experimental stage， the highest peak was reached at 8 dai， which was significantly higher than that of DH199S. The CAT activity of DH40R after inoculation reached the highest peak 1 572.68 μmol·mL-1·min-1 at 8 dai， which was significantly higher than the mock of DH40R and the inoculated and uninoculated DH199S. The MDA content of DH40R was significantly lower than that of DH199S at 8 and 13 dai. The soluble protein content in DH40R was higher than that of DH199S at 8 and 13 dai. Overall， these results can lay foundation for further exploration of resistance mechanism of B. rapa against P. brassicae infection.

Key words： Chinese cabbage; Clubroot; Infection; Physiological and biochemical index

根肿病是由芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae Woron.）侵染引起的全球范围内专性寄生于十字花科蔬菜作物的一种重要土传病害，在全世界多个国家均有分布，我国最早在西南部和中部地区发病且尤为严重[1]。十字花科感病植株被根肿菌侵染后，寄主植物的地上和地下部分在侵染早期均与正常植株无明显的差异，然而到侵染后期，寄主植株地上部分的叶片逐渐黄化、萎蔫，地下的根部组织逐渐形成肉眼可见的巨大根瘤，严重影响十字花科蔬菜作物的产量[2]。

芸薹根肿菌的生活史主要分成两个阶段，即初级（根毛）侵染和次级（皮层）侵染。在初级侵染时期，土壤中的休眠孢子在适宜条件下萌发成为初级游动孢子，游动到根毛后刺入细胞壁进入根毛，以初级原生质团的形式存在，寄主的表型此时没有变化。根毛中的游动孢子不断地分裂繁殖，形成游动孢子囊（内含有4～16个次生游动孢子），簇生在根毛中，次生游动孢子再次穿透细胞壁侵入皮层细胞，这个阶段称为次级侵染。次级游动孢子进入皮层细胞后扰乱根部的正常发育，导致皮层细胞不断分裂膨大并产生大量次级游动孢子囊，造成寄主的根部异常膨大[3-4]。刘亚奇[5]通过观察不同抗性油菜接种根肿菌后的根毛侵染变化，发现第5天时感病材料N109-7和抗病材料MC0411均出现根毛侵染，且第15天时感病材料出现大量的皮层侵染，而抗病材料未观察到皮层侵染。

当寄主植株被病原菌侵染后会产生一系列的防御反应，其中寄主抗性在生理生化方面主要与防御酶的代谢活性密切相关，常见的防御酶主要包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），过氧化氢酶（catalase，CAT）等，可能通过参与清除细胞内的活性氧，从而起重要的调控作用，因而防御酶的活性变化与植物的抗病性紧密相关[6]。当寄主植株体内遭受高活性氧水平的毒害时，SOD在清除自由基方面发挥作用，因此在植物的防御反应中SOD首先表现出重要作用[7]。况宁宁等[8]发现，大白菜侵染根肿菌后，根部的SOD活性明显高于未侵染对照组；孙胜男等[4]的研究结果表明，对两个抗性不同的萝卜品种接种根肿菌后，抗病型POD和SOD活性明显高于感病型。CAT主要是通过抗氧化作用来保护植物的细胞膜，清除植物组织中过多的H2O2，参与多种植物防御机制，增强植物的抗逆能力[9]。不同抗性的甘蓝品种接种根肿菌后，抗病甘蓝品种的SOD和CAT活性都高于耐病品种，后者高于感病品种，且在第10天时差异最为显著，即SOD和CAT活性越大则甘蓝的抗性越强[10]。另外，植物在遭受病原菌侵害以后，还伴随着其他非酶类生理指标的变化，比如丙二醛（malondialdehyde，MDA）和可溶性蛋白含量等，MDA是细胞膜脂质过氧化的产物，高含量的MDA表明植物膜脂受到严重损伤。朱红芳等[11]的研究表明，可溶性蛋白和MDA含量可以作为抗根肿病品种早期筛选的辅助生理指标。

大白菜（Brassica rapa L. ssp. pekinensis）属于芸薹属芸薹种（AA基因组，2n=20），是起源于我国的一种重要的十字花科蔬菜，在我国蔬菜供应中占有重要地位。而根肿病对大白菜危害严重，造成极大经济损失。笔者以两个抗病和感病大白菜DH系（DH40R和DH199S）为试材，从根肿菌侵染后的形态细胞学、生理生化指标等方面进行研究，以期从不同角度解析根肿病抗性机制。

1 材料与方法

1.1 材料

抗根肿病大白菜DH系DH40R（病情指数为0）和感根肿病大白菜DH系DH199S（病情指数为100）均是经过游离小孢子培养获得，由河南省农业科学院叶类蔬菜研究室提供，其根肿病抗性来源于欧洲芜菁ECD01。

供试菌株来自河南省南阳市新野县的大白菜肿根，经Williams系统鉴定为致病性更强的4号生理小种，经ECD鉴别系统鉴定为ECD21/31/31[12]。

接种、侵染过程观察和生理指标试验均于2019年7－9月在河南省农业科学院叶类蔬菜研究室的人工气候室、细胞及分子生物学实验室进行。

1.2 菌液的制备及接种

大白菜肿根经打碎、过滤、离心等抽提得到休眠孢子悬浮液，接种前用血球计数板调整悬浮液孢子浓度为（1～10）×107个·mL-1，将2个材料分别播种到无菌基质的50孔穴盘，在光照培养箱中进行培养，控制条件为：温度20～25 ℃，光周期16 h光照和8 h黑暗，播种后20 d采用注射法接种根肿菌，每个穴孔接种4 mL，对照采用等量蒸馏水处理[13]。

1.3 侵染过程观察

分别对根肿菌接种0、2、5、8、13、22 d的根部进行取样观察，用清水冲洗干净后，每个处理每个时期取3株幼苗根放置于0.5%荧光桃红染液中染色3 h，染色完成后，用胶头滴管吸取灭菌水滴加在载玻片中央，将染色后切下的侧根或主根放在液滴上，盖上盖玻片，小心按压盖玻片，用滤纸吸去多余水分，用显微镜（Leica Microsystems CMS GmbH Ernst-Leitz-Str.）观察根毛和皮层中根肿菌的侵染情况。

取接种后13和22 d清洗干净的3～5 mm大白菜主根部位，每个处理每个时期取3株置于FAA固定液中，切片和组织染色过程参照苏贺楠等[14]结球甘蓝花蕾石蜡切片的制作方法进行，制备好的切片用显微镜进行皮层侵染过程的观察。

1.4 酶粗液的提取

过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活性及丙二醛、可溶性蛋白含量这几个指标的测定第一步均是酶粗液的提取，将根部组织加液氮充分研磨后，称取约0.1 g粉末，转入2 mL离心管中，加入1 mL提取液（酶提取缓冲液），在12 000 r·min-1、4 ℃离心10 min，取上清液，即得到待测液，置于冰上备用。

1.5 过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活性以及丙二醛、可溶性蛋白含量的测定

以下测定均采用全波长读数仪进行测量，且试验前30分钟打开分光光度计进行预热。采用苏州格锐思生物科技有限公司的过氧化氢酶试剂盒测定CAT活性，采用超氧化物歧化酶（SOD）-WST法试剂盒测定SOD活性，采用丙二醛试剂盒（G0109F）测定丙二醛含量，采用考马斯亮蓝法测蛋白含量试剂盒（G0417F）测定可溶性蛋白含量，具体试验操作方法按照试剂盒的说明书步骤进行。测量每个指标时，每个时期（接种根肿菌后和未接菌对照组的2、8、13 d）各测量3株苗，设置3次重复。

1.6 数据处理与分析

采用SPSS 17.0进行统计分析，采用Excel 2010进行数据处理和图表绘制。

2 结果与分析

2.1 抗、感大白菜DH系接种根肿菌后的表型观察

通过对抗病大白菜DH系DH40R和感病大白菜DH系DH199S接种根肿菌后的形态学观察（图1），发现未接菌、接菌后2 d和5 d，DH40R和DH199S主根和侧根均未见小肿瘤产生，接菌后第8天，DH199S侧根处有小肿瘤产生，而DH40R主根和侧根均无明显异常，接菌第13和第22天，DH199S主根明显异常膨大，而DH40R的主根和侧根始终无明显异常，表现出完全的抗性。

2.2 抗、感大白菜DH系根毛及皮层侵染的组织学特征

通过对抗病大白菜DH系DH40R和感病大白菜DH系DH199S中根肿菌根毛侵染的过程进行荧光桃红染色观察（图2），发现未接菌时，DH40R和DH199S的根毛内是空荡的，未观察到根肿菌；接菌后第2天，DH40R的根毛中出现无固定形状的根肿菌原生质团，DH199S的根毛中充满原生质团状的根肿菌；接菌后第5天，DH40R的皮层细胞中观察到少量的游动孢子囊和次生游动孢子，DH199S的皮层细胞中出现大量游动孢子囊和次生游动孢子；接菌后第8天，DH40R的皮层细胞内存在少量的根肿菌次生游动孢子，DH199S的皮层细胞内遍布游动孢子囊和次生游动孢子。

接菌后第13和第22天，DH40R的根部无发病症状，DH199S的根部肿大，分别将DH40R和DH199S的主根部位制作石蜡切片，结果发现，接菌后第13天，DH40R的皮层细胞中存在少数未成熟的游动孢子，DH199S的皮层细胞中存在大量成熟的游动孢子；接菌后第22天，DH40R的皮层细胞内存在少量未成熟的游动孢子，皮层细胞发育正常，DH199S的皮层细胞异常肿大，皮层细胞内充满成熟的游动孢子囊和休眠孢子，大量异常肿大和异常分裂的皮层细胞挤压维管束组织。

综上，接菌后第2天，抗病大白菜DH系DH40R和感病大白菜DH系DH199S的根毛均开始被侵染，第8天，皮层细胞均被侵染，且DH199S根部出现小肿瘤，第13天及以后，DH40R在皮层侵染中抑制根肿菌进一步的生长繁殖，而DH199S无法抵抗根肿菌的生长繁殖，最终皮层细胞内充满根肿菌，根部肿大。

2.3 抗、感大白菜DH系接种后不同时间根部生理指标的变化

笔者推测在抗病大白菜DH系DH40R的皮层细胞中产生了某种抑制根肿菌分裂繁殖的物质，阻止其分裂繁殖和病情进一步恶化，这个物质可能是酶、次级代谢产物等。因此笔者对接菌和未接菌2、8、13 d的抗病和感病大白菜DH系进行相关生理指标的测定。

抗、感病大白菜DH系DH40R和DH199S接菌后2、8、13 d的SOD活性变化情况如图3-A所示，DH40R接种根肿菌后的SOD活性呈先上升后下降的变化趋势，且SOD活性均显著高于未接菌对照组，在接菌后第8天，DH40R中SOD活性达到峰值650.67 U·mL-1，显著高于接菌后的DH199S，在接菌后第13天，DH40R中SOD活性显著低于接菌后的DH199S。抗、感病大白菜DH系DH40R和DH199S接菌后CAT活性的变化趋势如图3-B所示，DH40R接种根肿菌后的CAT活性也呈先上升后下降的变化趋势，且接菌后第8天达到峰值1 572.68 μmol·mL-1·min-1，显著高于抗病大白菜DH系未接菌对照组，是接菌后感病大白菜DH系（554.20 μmol·mL-1·min-1）的2.84倍。

抗、感病大白菜DH系DH40R和DH199S接菌后2、8、13 d的MDA含量变化情况如图3-C所示，接菌后DH40R的MDA含量缓慢下降，在接菌后第13天，与未接菌的抗、感病大白菜差异不显著，但显著低于接菌后的DH199S。可溶性蛋白含量的变化趋势如图3-D所示，抗病大白菜DH系DH40R和感病大白菜DH系DH199S接菌和未接菌的可溶性蛋白含量均呈降低的变化趋势，接种第8和第13天，DH40R的可溶性蛋白含量高于DH40R未接菌对照组；DH199S在接种2、8、13 d，可溶性蛋白含量一直低于未接菌对照组；在接种第8和第13天，接菌后的DH40R的可溶性蛋白含量显著高于接菌后的DH199S。

3 讨论与结论

根肿菌侵染植株的过程主要包括根毛侵染和皮层侵染，研究表明，根肿菌在接种抗病寄主、感病寄主以及非寄主植株之后均会出现根毛侵染的现象[15-17]。近年来，学者们对十字花科作物抗根肿病的生理生化指标进行了测定，但多数研究仅集中在根肿病侵染早期或者晚期[18-21]。在本研究中，笔者结合细胞学观察根肿菌的整个侵染进程（根毛侵染和皮层侵染），对侵染起始到最终植株发病的整个周期进行生理生化指标的测定，依据这些生理生化指标在抗、感大白菜间的变化差异，进一步解析大白菜抗根肿病的生理生化防御机制。

Chen等[22]利用两个大白菜近等基因系CRBJN3-2（抗根肿病）和BJN3-2（感根肿病）接种根肿菌4号生理小种，接菌量为1 mL，在接菌后12、72、96 h观察根部侵染情况，结果发现两份材料在接菌12 h均出现根毛侵染现象，接菌72 h后，感病材料BJN3-2出现皮层侵染，而抗病材料CRBJN3-2在接菌后96 h也没有发生皮层侵染，接菌30 d后，BJN3-2根部产生根瘤，而CRBJN3-2根部无异常。本研究中抗病和感病大白菜DH系在接菌后第2 天，根毛中分别出现和充满了原生质团状的根肿菌；接菌后第5天，皮层细胞中均出现游动孢子；接菌后第8天，感病大白菜DH系DH199S的皮层侵染数较多，且开始初级发病，侧根处有小肿瘤，而抗病大白菜DH系DH40R虽皮层受到了侵染，但无发病症状，表明接菌后第8天，DH40R阻隔了根肿菌的侵染，可能是抗病大白菜DH系DH40R侵染后期没有发病的直接原因，而伴随着侵染时间的延长，感病大白菜DH系DH199S病情逐渐加重，皮层细胞中游动孢子数量不断增加，导致皮层细胞充满游动孢子，根部异常肿大。本研究的抗病材料中虽然也观察到了皮层侵染现象，但最终没有根瘤产生，这与Chen等[22]的研究结果次级侵染在抗病材料中没有发生并不一致。

植物被病原菌侵入之后，体内将会产生大量活性氧（ROS），如H2O2、O2-等，损坏细胞膜的结构和功能，植物为了阻止此现象发生，建立了抗氧化保护系统，其中就包括POD、SOD和CAT直接参与植物的抗病反应[23-26]。朱红丽[23]对分别接种4、8、12和16 d的白菜品种早熟长江5号和CR-英雄主根组织的一些生理生化指标进行测定，结果表明，接种根肿菌之后，抗病品种的CAT活性高于感病品种，抗感品种的SOD活性峰值均在第8天出现，且抗病品种的峰值显著高于感病品种。本研究中抗病大白菜DH系DH40R在整个侵染阶段，接菌后SOD活性均显著高于未接菌对照组，在接菌后第8天，DH40R中SOD活性达到峰值，显著高于接菌后的DH199S。抗病大白菜DH系DH40R的CAT活性第2天最低，但是高于接菌后的DH199S，接菌后第8天，DH40R的CAT活性达到峰值1 572.68 μmol·mL-1·min-1，显著高于抗病大白菜DH系未接菌对照组，是接菌后感病大白菜DH199S的2.84倍，说明CAT在接菌后第8天清除大量H2O2以维持DH40R体内的膜系统稳态，在抵抗根肿菌的侵害中发挥主要作用，与朱红丽[23]的研究结果一致。MDA含量能够作为反映细胞膜脂过氧化程度和植物受伤害程度的一个重要指标，MDA含量越高说明植物体遭受逆境的伤害越大[27]。从接菌后第2天开始，抗病大白菜DH系在接菌后整个过程MDA含量一直呈下降的趋势，仅在被根肿菌侵染根毛（接菌后第2天）时高于未接菌对照组和接菌后感病大白菜DH199S，接菌后第8和第13天，显著低于接菌后的DH199S，这说明抗病大白菜DH40R被根肿菌侵染后，根毛侵染阶段（接菌后第2天）的SOD和CAT等防御酶活性较低，还不能完全清除根内过氧化产物，随着侵染时间的延长，接菌后第8天，DH40R根中SOD和CAT活性达到峰值，可以清除根内过氧化产物，细胞膜的损伤较轻，膜脂过氧化程度不高，植株受伤害程度不重。可溶性蛋白是植物中最活跃的蛋白质成分，研究表明，可溶性蛋白含量与植物抗性的产生有一定关系[28-29]。在本研究中，接菌后第2天，抗病大白菜DH系DH40R中的可溶性蛋白含量低于未接菌对照和感病大白菜DH系DH199S，DH199S的可溶性蛋白含量也低于未接菌对照组，而在第8和第13天，DH40R中的可溶性蛋白含量高于感病大白菜DH系DH199S，且高于DH40R未接菌对照组，而DH199S中的可溶性蛋白含量低于未接菌对照组，而马丹丹[19]的研究表明，甘蓝感病品种可溶性蛋白含量上升，抗病品种可溶性蛋白含量降低，与笔者的研究结果不一致，推测可能与不同物种抵抗根肿菌侵染的机制不同有关。

综上所述，笔者通过形态细胞学观察两个不同根肿病抗性大白菜DH系在贯穿整个侵染过程的5个时间节点（接菌后2、5、8、13、22 d）的病情发展情况和根肿菌的侵染动态，另外对相关生理生化指标进行测定，发现在接菌后第8天，侵染时期和生理生化指标在抗、感材料之间存在显著性差异，推断在接菌后第8天是抗、感材料抗性差异产生的重要时期。该研究结果为后期挖掘根肿病抗性相关基因及解析根肿病抗性分子机制奠定了基础。

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