苦瓜枯萎病抗性生理研究及鉴定评价体系构建

凌怡，杨衍，牛玉，于仁波，刘昭华，刘平武，韩旭

摘    要：通过苦瓜枯萎病抗性生理研究，构建高效精准的苦瓜枯萎病抗性鉴定评价体系，旨在为苦瓜抗枯萎病种质资源筛选及抗病品种选育提供理论基础。以热科2号苦瓜为试验材料，选用灌根法、胚根法和伤根法在苦瓜2叶1心期接种不同浓度的苦瓜枯萎病菌，分析不同接种时间的病情指数和生理响应的差异情况，以及不同接种方法和接种浓度对病害的影响。结果表明，采用灌根法接种1×106 个·mL-1的枯萎病菌，在第25天时病情指数为37.1，显著低于1×107 个·mL-1、显著高于1×104 个·mL-1，苯丙氨酸解氨酶活性和叶绿素含量显著低于胚根法，多酚氧化酶活性与可溶性蛋白含量与胚根法相比无显著差异。在苦瓜幼苗2叶1心时采用灌根法接种1×106 个·mL-1的枯萎病菌，25 d时鉴定发病情况，可作为精准高效鉴定苦瓜枯萎病抗性的体系。

关键词：苦瓜；枯萎病；病情指数；抗性生理；鉴定评价技术

中图分类号：S642.5 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）06-069-10

Resistance physiological study and evaluation system establishment on Fusarium wilt of bitter gourd

LING Yi1， 2， YANG Yan2， NIU Yu2， YU Renbo2， LIU Zhaohua2， LIU Pingwu1， HAN Xu2

（1. College of Tropical Agroforestry， Hainan University， Haikou 570228， Hainan， China; 2. Tropical Crop Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou 571101， Hainan， China）

Abstract： Through the study of bitter gourd Fusarium wilt resistance physiology， the authors have constructed an efficient and precise identification and evaluation system for bitter gourd Fusarium wilt resistance， aiming to provide a theoretical basis for the screening and evaluation of Fusarium-resistant germplasm resources and the selection and breeding of disease-resistant varieties. In this study， Reke No. 2 bitter gourd was used as the test material， and selected the root irrigation， radicle root and injure root methods to inoculate different concentrations of Fusarium wilt fungus liquid at the time of two-leaf and one heart of bitter gourd， and investigated the effects of different inoculation methods and inoculation concentrations on the Fusarium wilt by analyzing the differences in disease index and physiological responses at different inoculation times. The results showed that the disease index was 37.1 using the root irrigation inoculated fungus with 1×106·mL-1 at 25 d， which was significantly lower than that of 1×107·mL-1， and significantly higher than that of 1×104 ·mL-1. PAL activity and chlorophyll content were significantly lower than the radicle method， and no significant difference existed between PPO activity and soluble protein content. When bitter gourd seedlings of two-leaf and one heart were inoculated with 1×106·mL-1 fungus using the root irrigation method， the disease incidence was identified at 25 d， which can serve as an accurate and efficient identification system of bitter gourd Fusarium wilt resistance.

Key words： Bitter gourd; Fusarium wilt; Disease index; Resistance physiology; Identification and evaluation technology

苦瓜（Momordica charantia L.）属葫芦科苦瓜属植物，是重要的食药同源蔬菜作物，亦是海南省冬种北运的主要蔬菜作物，占据着冬季蔬菜市场的重要份额[1]。苦瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌苦瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. momordicae）引起的一种严重影响苦瓜产量和品质的土传病害，在任何生育期均能侵染并造成危害，严重时可引起整株萎蔫死亡[2]。随着复种指数的逐年增加，苦瓜枯萎病日益加剧，严重制约着苦瓜产业的健康发展[3]。苦瓜枯萎病菌在土壤中的存活力和致病力较强，难防难治，选育抗病品种是最经济有效的方法，而高效精准的鉴定评价技术体系是抗病品种选育的重要基础。近年来有关瓜类作物枯萎病抗性鉴定评价的研究多集中在黄瓜和西瓜上，关于苦瓜枯萎病抗性鉴定技术的研究鲜有报道[4]，目前仍未形成精准完善的高效鉴定评价技术体系。尖孢镰刀菌常用的接种方法有灌根法、胚根法、伤根法、蘸根法、浸根法等[5]。左存武等[6]用浸根法和灌根法将Foc TR4接种不同抗性的香蕉品种，比较分析接种后香蕉的发病情况，结果表明，灌根法的接种效果最好，接种后各品种发病情况与品种本身的实际抗性最为接近。种质来源、环境条件、接种方法、接种浓度、鉴定时间等均能影响苦瓜枯萎病的抗性鉴定，因此，制定简单、高效、统一的鉴定评价技术方案是解决这一问题的重要手段。笔者以中抗枯萎病品种热科2号苦瓜为试验材料，采用不同接种方法、不同菌液浓度、不同鉴定时间等方法研究苦瓜枯萎病的抗性生理机制，综合分析病情指数、根系形态及各项生理指标等，构建高效精准的鉴定评价技术体系，为提高苦瓜种质枯萎病鉴定评价效率和精准度及抗病品种选育提供理论和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

苦瓜品种热科2号是中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所自主选育的中抗枯萎病品种。

供试病原菌：苦瓜枯萎病致病菌尖孢镰刀菌4501（Fusarium oxysporum f. sp. momordicae），由广西农业科学院蔬菜研究所陈振东研究员提供。

1.2 方法

试验于2023年6－7月在中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所植物培养室及抗逆生理与分子生物学实验室完成。

1.2.1 浸种催芽 供试苦瓜种子浸泡于55 ℃温水中8 h，用湿润的4层纱布包裹种子，放置在28 ℃培养箱中培养2～3 d，种子露白待用。

1.2.2 枯萎病菌菌液的制备 试验以清水为对照（CK），以不同孢子浓度（1×104、1×105、1×106、1×107个·mL-1）的尖孢镰刀菌4501为处理。在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上接种尖孢镰刀菌4501，置于28 ℃培养箱中培养7 d，使用打孔器取直径7 mm的尖孢镰刀菌菌饼接种至马铃薯葡萄糖肉汤培养基（PDB）中，在温度为28 ℃、120 r·min-1的条件下振荡培养7 d，然后用双层纱布过滤菌丝，留母液待用。

1.2.3 接种方法 为提高鉴定评价的精准度，所有试验均在人工培养室中进行，室内温度保持在（28±1） ℃，湿度80%，光照度2500 lx。分别对灌根法、胚根法和伤根法3种接种方法的病情指数和抗病等级进行鉴定，筛选适宜的接种方法。

灌根法：将露白的苦瓜种子播种于装满灭菌基质的营养钵（7 cm×7 cm）中，置于塑料托盘内（每个托盘放21个营养钵），每隔2 d在托盘中加入500 mL水以保证基质湿润。待苦瓜幼苗生长至2叶1心时采用灌根法接种枯萎病菌[7]，在距根际1 cm处用注射器注入20 mL菌液，菌液中分生孢子浓度分别为1×104、1×105、1×106、1×107 个·mL-1，随机区组排列，3次重复，每次重复63株幼苗，共252株苗。

胚根法：种子露白后待胚根长至1 cm时采用胚根法接种枯萎病菌[8]，将种子浸泡在菌液中1 h，菌液中分生孢子浓度分别为1×104、1×105、1×106、1×107 个·mL-1，后将种子播于装满无菌基质的营养钵中，并置于塑料托盘内，随机区组排列，3次重复，每次重复63株幼苗，共252株苗。

伤根法：将露白的苦瓜种子播种于装满灭菌基质的营养钵中，并置于塑料托盘内，当幼苗长至2叶1心时采用伤根法接种枯萎病菌[9]，将幼苗根部基质洗净，剪掉根的三分之一，在孢子悬浮液中浸泡30 min，菌液中分生孢子浓度分别为1×104、1×105、1×106、1×107 个·mL-1，后将幼苗重新移栽至无菌基质中，随机区组排列，3次重复，每次重复63株幼苗，共252株苗。

1.2.4 测定指标与方法 选择2种适宜的接种方法，分别于接种后0、5、10、15、20和25 d采集根系和同一叶位（第1、2片真叶）的叶片样品，每个处理随机取9株，设3次重复，根系样品拍照用以分析根系形态，叶片用锡纸包裹迅速转移至液氮中速冻，取样完成后将叶片样品储存于-80 ℃超低温冰箱中，待测各项生理指标。采用胚根法接种菌液的植株在0 d时还处于种子阶段，因此在0 d时无法进行叶片取样。

取0.2 g苦瓜叶片样品放置于已预冷的研钵中，随后加入1 mL pH=7.8的磷酸缓冲液，在冰浴条件下将其研磨成匀浆，然后使用磷酸缓冲液冲洗研钵及研磨棒，将其倒入匀浆中，使总体积为10 mL。将样品在4 ℃条件下进行10 000 r·min-1的离心操作，离心20 min后得到上清液，上清液作为苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）以及可溶性蛋白质的提取液。参照邹芳斌等[10]的方法测定PAL活性，参照郑莲姬等[11]的方法测定PPO活性，参照王凤婷等[12]的方法测定叶绿素含量，参照青格尔等[13]的方法测定可溶性蛋白含量。

采用万深LA-S系列植物图像根系分析系统对根系形态进行分析。

1.3 抗病分级标准

病情指数（DI）=Σ（病株数×该级代表值）/（总株数×最高级代表值）×100。

参考南宇航等[14]的鉴定方法，调查病情指数，植株被定为0～5级：0级，无病症；1级，子叶萎蔫或部分子叶与真叶轻微萎蔫；2级，1片真叶萎蔫或子叶较重萎（≤60%）；3级，子叶及部分真叶萎蔫（＞60%）；4级，整株萎蔫，60%以上枯死，但心叶仍成活；5级，整株枯死。苦瓜枯萎病病情分级详见图1。

抗性分级标准：高抗（HR）：DI＜10；抗病（R）：10≤DI＜30；中抗（MR）：30≤DI＜50；感病（S）：50≤DI＜70；高感（HS）：DI≥70。

1.4 统计分析

利用Microsoft Excel 2016软件进行数据整理和作图，利用SPSS26软件进行单因素方差分析和显著性差异检验。

2 结果与分析

2.1 不同接种方法及菌液浓度对苦瓜枯萎病病情指数的影响

如表1所示，不同接种方法和菌液浓度对苦瓜枯萎病发病情况的影响不同。灌根法接种的苦瓜幼苗病情指数随着菌液浓度的增加而提高，且菌液浓度为1×105和1×106 个·mL-1的处理间无显著差异，抗病等级分别为R、MR、MR、S；胚根法各菌液浓度间病情指数无显著差异，抗病等级均为MR；伤根法菌液浓度为1×104个·mL-1时病情指数显著低于菌液浓度为1×105、1×106、1×107 个·mL-1的处理，抗病等级分别为S、HS、HS、HS。不同接种方法及不同菌液浓度均不同程度影响苦瓜对枯萎病的抗性表型。采用伤根法接种苦瓜枯萎病菌病情指数过高，抗病等级为感病或高感，无法准确鉴定出品种抗性。为保证苦瓜枯萎病抗性鉴定评价体系的精准性，笔者选择灌根法及胚根法进行下一步研究。

2.2 不同接种方法及菌液浓度对苦瓜叶片苯丙氨酸解氨酶活性的影响

如图2所示，灌根法接种不同浓度枯萎病菌后的苦瓜叶片PAL活性呈不同的变化趋势，接种后25 d时，菌液浓度为1×106 个·mL-1的处理苦瓜叶片及未接菌处理的苦瓜叶片PAL活性显著低于其他处理。胚根法接种不同浓度枯萎病菌后的苦瓜叶片PAL活性呈不同的变化趋势，接种25 d时未接菌处理的苦瓜叶片PAL活性低于接菌处理。采用胚根法接种浓度为1×105和1×106 个·mL-1的枯萎病菌菌液分别在20和25 d时，苦瓜叶片PAL活性显著高于灌根法，而接种菌液浓度为1×107 个·mL-1在25 d时显著低于灌根法。

2.3 不同接种方法及菌液浓度对苦瓜叶片多酚氧化酶活性的影响

灌根法和胚根法接种不同浓度枯萎病菌后的苦瓜叶片PPO活性表现出不同的变化趋势（图3）。灌根法接种后20 d各菌液浓度处理间PPO活性无显著差异，第25天时各菌液浓度处理间PPO活性高于未接菌处理，仅1×107 个·mL-1处理与CK呈显著差异。胚根法接种后20 d，菌液浓度为1×106 个·mL-1的处理叶片PPO活性显著高于其他菌液浓度及未接菌处理，接种后25 d各菌液浓度处理间PPO活性无显著差异。菌液浓度为1×106 个·mL-1的处理接种后20 d，胚根法的叶片PPO活性显著高于灌根法。胚根法及灌根法接种不同浓度菌液25 d的苦瓜叶片PPO活性无显著差异。

2.4 不同接种方法及菌液浓度对苦瓜叶片叶绿素含量的影响

灌根法接种不同浓度枯萎病菌后的苦瓜叶片叶绿素含量在0～5 d无显著差异，15～25 d未接菌处理的叶片叶绿素含量显著高于接菌处理（图4）。灌根法接种后20 d，菌液浓度为1×104 个·mL-1的处理苦瓜叶片叶绿素含量显著高于其他接菌处理，接种后25 d，菌液浓度为1×107 个·mL-1的处理叶绿素含量低于其他菌液浓度处理。胚根法接种后20和25 d，未接菌处理的叶片叶绿素含量高于接菌处理；接种20 d后，菌液浓度为1×104 个·mL-1处理的苦瓜叶片叶绿素含量显著高于其他菌液浓度处理，接种25 d，菌液浓度为1×106 个·mL-1处理的苦瓜叶片叶绿素含量显著高于菌液浓度为1×104、1×107 个·mL-1的处理。菌液浓度为1×104、1×107 个·mL-1的处理接种后20 d，灌根法的叶片叶绿素含量极显著或显著低于胚根法，而菌液浓度为1×105 个·mL-1的处理，灌根法显著高于胚根法。采用灌根法接种浓度为1×105、1×106、1×107 个·mL-1的处理接种后25 d，苦瓜叶片叶绿素含量极显著或显著低于胚根法。

2.5 不同接种方法及菌液浓度对苦瓜叶片可溶性蛋白含量的影响

如图5所示，灌根法接种不同浓度枯萎病菌后的苦瓜叶片可溶性蛋白含量呈不同的变化趋势，接种20 d时各处理间无显著差异，25 d时接菌浓度为1×104 个·mL-1的叶片可溶性蛋白含量显著低于其他接菌浓度。胚根法接菌20 d的苦瓜叶片，接菌浓度为1×106 个·mL-1处理的叶片可溶性蛋白含量显著高于CK和其他接菌浓度，25 d时叶片可溶性蛋白含量随接菌浓度的增加而降低，CK显著高于接菌处理。采用灌根法接种20 d，接菌浓度分别为1×105、1×106、1×107 个·mL-1处理的苦瓜叶片可溶性蛋白含量均极显著或显著低于胚根法。接种25 d，灌根法接菌浓度分别为1×104、1×105、1×107 个·mL-1处理的苦瓜叶片可溶性蛋白含量均极显著或显著低于胚根法。

2.6 不同接种方法及菌液浓度对苦瓜根系形态的影响

如表2所示，灌根法接种枯萎病菌的苦瓜根系长度随菌液浓度增加呈下降趋势，表面积和体积无显著差异，菌液浓度为1×106 个·mL-1处理的根尖数及分叉数显著低于其他处理。胚根法接种枯萎病菌在菌液浓度为1×105、1×106 、1×107 个·mL-1处理的根系长度显著低于1×104个·mL-1的处理，表面积和体积无显著差异，根尖数及分叉数随着菌液浓度的增加呈降低趋势。从对照以及灌根法、胚根法不同接菌浓度处理的根系形态图（图6）可以看出，随着接菌浓度的升高，植株受枯萎病菌侵染程度加重，根系生长受到的影响也加重。

3 讨论与结论

不同接种方法、菌液浓度、鉴定时间等均会影响抗性鉴定的准确性[15]。笔者采用3种不同方法接种不同浓度的苦瓜枯萎病菌，通过病情指数筛选出最适宜的接种方法。经比较分析，笔者认为适用于鉴定苦瓜枯萎病的接种方法依次为灌根法、胚根法、伤根法。在3种不同接种方法中，灌根法接种枯萎病菌的优点是发病整齐且有规律性，易于鉴定植株枯萎病抗性等级。胚根法接种枯萎病菌可能由于在菌液浸种时胚根吸收的菌液不足，以致苦瓜植株发病或胚根法本身致病力弱、发病率低，品种未表现出应有抗性，不同接菌浓度间病情指数无显著差异，难以准确判断枯萎病侵染程度，不利于对苦瓜植株抗性进行分级。伤根法可能由于在接种菌液过程中进行了伤根处理导致根系损伤，使苦瓜植株受枯萎病菌的影响发病程度较重，从而导致病情指数过高且死苗过多，难以进行抗性分级，不利于筛选精准的鉴定评价体系。因此，笔者认为灌根法是最适用于接种苦瓜枯萎病菌进行抗病性鉴定的接种方法。

接种浓度过低会导致发病率低，抗性种质假阳性现象增加，病情潜伏期长，导致鉴定周期延长，影响鉴定效率[16]；接种浓度过高，无法进行病情分级和筛选出抗性种质[17]。笔者采用4种不同接菌浓度对苦瓜进行枯萎病菌的接种，菌液浓度分别为1×104、1×105、1×106、1×107 个·mL-1，经比较分析，认为采用菌液浓度为1×106 个·mL-1对苦瓜进行枯萎病菌的接种为最适浓度，选用灌根法接种1×106 个·mL-1的枯萎病菌的植株，病情指数显著低于接种1×107 个·mL-1枯萎病菌的植株，但显著高于接种1×104 个·mL-1枯萎病菌的植株。采用适当浓度接种枯萎病菌有利于提高苦瓜枯萎病抗性鉴定的准确性。这与前人研究结果一致，杨凡等[18]研究认为当病原菌孢子最适接种浓度为1×106个·mL-1时，能够有效区分黄瓜枯萎病抗感性差异。

苯丙氨酸解氨酶活性在植物抗病、抗虫、抗逆境胁迫等方面起重要作用[19]。在本研究中，采用灌根法接种浓度为1×106 个·mL-1枯萎病菌的处理，接种25 d的苦瓜叶片PAL活性显著低于菌液浓度为1×107 个·mL-1的处理。苦瓜幼苗遭受枯萎病病原菌侵染后，叶片中PAL活性随着枯萎病发病率升高呈先上升后下降再上升的变化趋势，说明PAL具有抵御枯萎病菌的作用。这与关峰等[20]研究结果相似，该结果表明，在枯萎病菌胁迫下，苦瓜叶片中的PAL活性随着接种时间的延长呈先上升后趋于平稳的趋势，较对照PAL活性均有大幅升高，且抗病品种PAL活性显著高于感病品种。PAL在苯丙烷代谢途径中起重要作用，使植物对逆境或细胞组织衰老做出应激反应，其活性与植物抗病性呈正相关[21]。

多酚氧化酶活性可作为植物抗病能力的生理指标。在本研究中，灌根法接种枯萎病菌25 d的苦瓜叶片PPO活性略高于胚根法。叶片中PPO活性在枯萎病菌的胁迫下，呈先下降再升高的趋势。本研究结果与前人一致，赵秀娟等[22]研究结果表明，接种后植株茎基部PPO活性均呈明显升高的趋势，感病自交系叶片PPO活性显著高于未接种对照。在苦瓜植株受到枯萎病菌胁迫时叶片防御酶系统启动，酶活性升高，随着侵染的加剧，超出了防御酶的清除能力时，酶活性下降。

叶绿素是植物中非常重要的色素，当病原菌入侵植物后，往往导致叶绿体解体，影响叶绿体的生物合成，出现叶片褪绿、黄化或花叶等症状，从而引起叶绿素含量降低[23]。叶绿素含量的高低往往能客观反映植物抗病性的强弱[24]。随着枯萎病菌对植株侵染程度的加重，叶片萎蔫，叶绿素含量也随之降低。本研究中枯萎病菌液浓度为1×104、1×105、1×107 个·mL-1 3个处理接种后20 d，胚根法接种的叶片叶绿素含量显著高于灌根法；25 d的叶绿素含量灌根法则低于胚根法。

在植物生长发育过程中可溶性蛋白含量会发生变化，当植物组织受外界侵染时可溶性蛋白含量也会随之变化[25]。本研究结果表明，胚根法接种枯萎病菌20和25 d的叶片可溶性蛋白含量高于灌根法。灌根法致病力强于胚根法，叶片受枯萎病菌侵染程度高，枯萎病菌的侵染影响了叶片的可溶性蛋白含量，随着枯萎病病原菌对苦瓜幼苗的侵染，叶片中可溶性蛋白含量呈下降趋势。吴美艳等[26]研究表明，木薯苗期接种病原菌叶片的可溶性蛋白含量较不接菌对照呈下降趋势，与本研究结果一致。

综上所述，笔者认为在苦瓜2叶1心时采用灌根法接种浓度为1×106 个·mL-1的苦瓜枯萎病菌的孢子悬浮液20 mL，接菌后25 d进行苦瓜枯萎病抗病性鉴定，是精准高效的枯萎病抗性鉴定评价技术体系。

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