高效液相色谱法检测猪肝中泰乐菌素残留

【摘要】该研究旨在开发一种用于检测猪肝中泰乐菌素残留量的高效液相色谱（HPLC）检测方法。通过离心分离、浓缩等前处理方法处理样品，用高效液相色谱法提取样品中的泰乐菌素残留量。添加样在60μg/kg、100μg/kg、200μg/kg三个浓度下的泰乐菌素，回收率为71.15%～108.09%，相对标准偏差均小于10%（n=6）。通过实验可以得出，此方法能快速、准确地测定出猪肝中泰乐菌素残留量。

【关键词】猪肝；高效液相色谱法；泰乐菌素

【DOI编码】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.03.003

Analysis of Tylosin Residue in Pig Liver Using High Performance Liquid Chromatography Method

JI Yuan

（Liaoning Inspection， Examination & Certification Centre， Shenyang 110036， China）

Abstract： This study aimed to establish an HPLC analysis protocol for detecting tylosin residues in pig liver. Methods：The samples were extracted by dichloromethane， purified by centrifugation and stratification， determined by high performance liquid chromatography and quantified by external standard method. Results：The recoveries were ranged from 71.15% to 108.09% for tylosin residues with 3 spiked levels of 60， 100 and 200μg/kg.The RSDs were below 10%（n=6）. Conclusion：The proposed method is fast， accurate， which is suitable for detecting tylosin residues in pig liver.

Keywords： pig liver； high performance liquid chromatography； tylosin

酒石酸泰乐菌素，化学式为C46H77NO17·C4H6O6，CAS号1405-54-5，其为白色至淡黄色粉末，易溶于水。由于它易于吸收且在体内扩散快，可以迅速提高血液中的药物浓度。酒石酸泰乐菌素具有广泛的抗菌谱，其分子结构稳定且生物活性高，能显著促进生长，因此被广泛用于畜禽疫病的预防和治疗。制定此方法旨在确保生猪在饲养过程中泰乐菌素的使用不超过安全限量。肝脏作为代谢器官易残留药物，检测猪肝中的泰乐菌素残留可以更好地确保在屠宰、销售等环节中，泰乐菌素残留在限定范围内。这有助于减少细菌耐药性，规范泰乐菌素的添加和使用。

1仪器与试剂

1.1主要仪器

Waters高效液相色谱仪、分析天平、离心机、氮吹仪、振荡器、涡旋仪。

1.2试剂与试样

标准品：酒石酸泰乐菌素（纯度98.0%），相对分子质量为1066.19。

试剂：甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、二氯甲烷（分析纯）、盐酸（分析纯）、高氯酸钠（分析纯）等。

试样：猪肝空白样。

2方法

2.1标准品和流动相

标准品储备液配制：准确称取泰乐菌素标准品23.3 mg（相当于泰乐菌素A20.0 mg），用甲醇定容，配制成浓度为200μg/mL的储备液，2～8℃冷藏，有效期30天。

工作液配制：取储备液5.0 mL，用甲醇定容，配制成浓度为10.0μg/mL的工作液，2～8℃冷藏，有效期7天。

高氯酸钠溶液配制：取高氯酸钠200 g，加入800 mL水，完全溶解后，用盐酸调节pH至2.5，再定容至1000 mL。

流动相配制：乙腈与高氯酸钠溶液按2∶3体积比混合，过0.45μm滤膜。

复溶液配制：乙腈与水按1∶1体积比混合后，超声脱气。

2.2前处理

两次提取：取猪肝样约（5±0.05）g至离心管A中，加入15 mL二氯甲烷，旋涡1 min，再将离心管A放入振荡器中，振荡提取5～10 min，离心10 min（转速为5000 r/min），吸取上清液至离心管B，静置；用10 mL二氯甲烷再次对离心管A中样品进行提取，振荡5～10 min，离心5 min（转速为10000 r/min），提取上清液至离心管C，静置。

净化：用一次性吸管吸取离心管B和C上层杂质，弃掉。将下层（二氯甲烷层）澄清液转移至25 mL容量瓶中，用二氯甲烷定容。将定容后的溶液转移至50 mL离心管D中，离心5 min（转速为10000 r/min），移取离心管D中澄清液10.0 mL，氮吹仪（50℃以下）吹干。取1.0 mL 50%乙腈溶液溶解残留物，涡旋1 min，离心5 min（转速为10000 r/min），移取澄清液，过膜（0.45μm）备用。

2.3标准曲线

准确移取适量工作液，用流动相稀释，配制成50μg/L、100μg/L、200μg/L、400μg/L、600μg/L、800μg/L、1000μg/L标液。以标准溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，得出回归方程及相关系数。

2.4液相条件

3结果与分析

3.1色谱条件的选择

3.1.1原子吸收分光光度法

试验发现，高氯酸钠会影响泰乐菌素的峰形、峰宽以及基线噪音。在流动相中增加一定比例的高氯酸钠含量会使峰形尖锐且峰宽变小，但是噪音也随之变大。另外，提高乙腈比例能够使泰乐菌素出峰时间缩短。通过调整乙腈和高氯酸钠的体积比发现，在体积比为2∶3时，出峰时间可控制在5～10 min内，且峰形良好。

3.1.2检测波长选择

波长扫描试验发现，在280～290 nm处，杂质干扰较小，响应值大，见图1。

3.2前处理条件优化

本方法前期进行了固相萃取小柱净化试验，分别用实验室现有的C18小柱、MCX小柱、HLB小柱、MAX小柱、SCX小柱对样品进行过滤提取处理，并计算回收率。C18小柱的平均回收率为73%，HLB小柱的平均回收率为71%，其他净化柱回收率均小于60%。同时，在过滤过程中，清除脂溶性杂质的效果不理想，等待时长较长。相比较而言，离心、氮吹处理方式更优。

3.3线性范围

移取标准品工作液1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL于50 mL容量瓶中，稀释至200μg/L、400μg/L、600μg/L、800μg/L、1000μg/L，每个浓度重复进样2次，以峰面积为对应浓度，得出标准曲线为C=0.0321A-0.0489，相关系数r= 0.9996，试验结果见表1。

3.4检出限和定量限

按照3倍基线噪音为检出限、10倍基线噪音为定量限的要求，依据GB 31650—2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留量限量》规定，猪肝中泰乐菌素的最高残留限量为100μg/kg，得出本标准中泰乐菌素的检出限为30μg/kg。

3.5回收率和精密度

在空白猪肝样品中加入60μg/kg、100μg/kg、200μg/kg泰乐菌素溶液做回收实验，精密度均小于10%。回收率在71.15%～108.09%之间，符合相关要求，详见表2。

3.6样品测定

在辽宁省内随机购买15批次猪肝样品，均未检测出泰乐菌素。

3.7泰乐菌素色谱图

泰乐菌素标准品色谱图、空白样品色谱图、添加样品色谱图分别见图2、图3、图4。

4结束语

此方法通过优化提取液比例，缩短了出峰时间，提高了残留的回收率并保证了色谱分离效果；比较了不同净化提取方式，最终得到了损失最小的前处理方式。通过实验数据可以看出，该方法线性良好，相关系数、定量限、回收率均符合标准要求，且能够准确、快速、便捷地测定出猪肝中泰乐菌素的残留，具有很高的可操作性。

【参考文献】

[1]刘佳，郝生燕，潘发明.动物产品中泰乐菌素残留规律研究进展[J].畜牧与兽医，2022，54（4）：148-152.

[2]刘敬先.高效液相色谱法检测鸡蛋中泰乐菌素残留[J].食品安全质量检测学报，2019，10（11）：3329-3333.

[3]刘敬先.HPLC法分析猪肉中泰乐菌素残留[J].现代畜牧兽医，2019（1）：12-16.

[4]罗玉莹，王艳，李艳萍.高效液相色谱法检测鸡肉中的泰乐菌素[J].石油化工应用，2018，37（6）：127-130.

[5]马青超.鸡蛋中兽药残留的检测方法及防控措施[J].现代畜牧科技，2017（8）：153.

[6]包洁华，张金霞，郭强功，等.高效液相色谱法测定酒石酸泰乐菌素有关物质的研究[J].中国兽药杂志，2015，49（2）：35-39.

[7]杨娜娜，刘聚祥，王琳，等.鸡蛋中兽药残留及检测技术的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医，2015（3）：226-228.

[8]张倩，杨琛，莫德清，等.水溶液性质对泰乐菌素光降解的影响[J].农业环境科学学报，2014，33（1）：2444-2449.

[9]刘勇军，姜艳彬.固相萃取-高效液相色谱法测定猪肉与鸡肉中替米考星、泰乐菌素残留量[J].肉类研究，2012，26（12）：12-15.

[10]王莹，张素霞，程林丽，等.超高效液相色谱-串联质谱法检测猪肝中乙酰异戊酰泰乐菌素残留[J].中国畜牧兽医，2011，38（10）：224-227.

[11]张眉，龚月生，马国际.泰乐菌素检测方法研究进展[J].畜牧兽医杂志，2009，28（3）：41-43.

【作者简介】

纪源，女，1988年出生，畜牧师，学士，研究方向为畜牧饲料、进口宠物饲料、酶制剂活性等畜牧领域理化指标检测。

（编辑：李钰双）