马钱苷调节AKT/AMPK/Nrf2通路改善氧葡萄糖剥夺/复氧诱导的神经元铁死亡的机制研究

杨祎 贾健 魏小利 苟平平 袁媛 高李

摘要 目的： 探讨马钱苷通过调节蛋白激酶B（AKT）/腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/核因子.E2相关因子2（Nrf2）通路改善氧葡萄糖剥夺/复氧（OGD/R）诱导的神经元铁死亡的机制。 方法： 将神经元分为对照组、OGD/R组、OGD/R＋L.马钱苷组、OGD/R＋M.马钱苷组、OGD/R＋H.马钱苷组、OGD/R＋H.马钱苷＋ML385组。透射电子显微镜观察神经元线粒体形态；检测铁含量、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）活性、4.羟基壬烯醛（4.HNE）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、还原型谷胱甘肽（GSH）/氧化型谷胱甘肽（GSSG），还原型辅酶Ⅱ（NADPH）/辅脱氢酶Ⅱ（NADP ＋）及乳酸脱氢酶（LDH）含量；使用CM.H2DCFDA、C11.BODIPY581/591分别检测细胞内和脂质活性氧（ROS）水平；四唑盐（MTT）试剂盒检测细胞活性；蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测B细胞淋巴瘤2（Bcl.2）、Bcl相关X蛋白（Bax）、剪切的半胱天冬氨酸蛋白酶3（cleaved Caspase.3）、磷酸化的蛋白激酶B（p.AKT）/AKT、磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶（p.AMPK）/AMPK、Nrf2蛋白表达。 结果： OGD/R组神经元线粒体出现碎片化现象，嵴减少，线粒体膜密度有所增 加。与对照组比较，OGD/R组GSH/GSSG、NADPH/NADP ＋、SOD、GPX4相对活性、 细胞活力以及Bcl.2水平、p.AKT/AKT、p.AMPK/AMPK、  Nrf2水平下降（ P ＜0.05），Fe  2＋ 含量、细胞内ROS水平、脂质ROS水平以及4.HNE、MDA水平、LDH释放量、Bax以及cleaved Caspase.3 水平上升（ P ＜0.05）；马钱苷处理后神经元线粒体中的线粒体嵴变得较为完整，碎片化现象消失，OGD/R＋L.马钱苷组、OGD/R＋M.马钱苷组、OGD/R＋H.马钱苷组较OGD/R组GSH/GSSG、NADPH/NADP ＋、SOD、GPX4相对活性、细胞活力以及Bcl.2水平、p.AKT/AKT、p.AMPK/AMPK、Nrf2水平上升（ P ＜0.05），Fe  2＋ 含量、 细胞内ROS水平、脂质ROS水平以及4.HNE、MDA水平、LDH释放量、Bax 以及cleaved Caspase.3水平下降（ P ＜0.05），且随着马钱苷剂量的增加，改善效果更显著；OGD/R＋H.马 钱苷＋ML385组以上指标与OGD/R组趋势一致。 结论： 马钱苷可能通过调节AKT/AMPK/Nrf2通路改善OGD/R诱导的神经元铁死亡。

关键词  氧葡萄糖剥夺/复氧；铁死亡；马钱苷；蛋白激酶B/腺苷酸活化蛋白激酶/核因子.E2相关因子2通路；神经元

doi：  10.12102/j.issn.1672.1349.2024.09.010

Mechanism of AKT/AMPK/Nrf2 Regulated by Loganin to Improve Ferroptosis Induced by Oxygen Glucose Deprivation/Reoxygenation

YANG Yi， JIA Jian， WEI Xiaoli， GOU Pingping， YUAN Yuan， GAO Li

Baoji Central Hospital， Baoji 721000， Shaanxi， China

Corresponding Author  GAO Li， E.mail： gaoli1980g@163.com

Abstract Objective： To investigate the mechanism of loganin improves the ferroptosis induced by oxygen glucose deprivation/reoxygenation（OGD/R） by regulating protein kinase B（AKT）/adenylate activated protein kinase（AMPK）/nuclear factor E2 associated factor 2（Nrf2） pathway.   Methods： The neurons were divided into control group，OGD/R group，OGD/R＋L.loganin group，OGD/R＋M.loganin  group，OGD/R＋H.loganin group，OGD/R＋H.loganin＋ML385 group.The morphology of neuron mitochondria was observed by transmission electron microscope.Iron content，glutathione peroxidase 4（GPX4） activity，4.hydroxynonenal（4.HNE），superoxide dismutase（SOD），malondialdehyde（MDA），reduced glutathione（GSH）/oxidized glutathione（GSSG），reduced Coenzyme Ⅱ（NADPH）/Codehydrogenase Ⅱ（NADP ＋），and Lactate dehydrogenase（LDH） content were determined.Intracellular and lipid reactive oxygen species（ROS） levels were detected by CM.H2DCFDA and C11.BODIPY581/591，respectively.MTT assay was used to detect cell activity.B.cell lymphoma 2（Bcl.2），Bcl.associated X protein（Bax），cleaved Caspase.3，phosphorylated protein kinase B（p.AKT）/AKT，phosphorylated adenylate activated protein kinase（p.AMPK）/AMPK，Nrf2 protein expression were detected by Western Blot.  Results： In OGD/R group，mitochondrial fragmentation occurred，ridge decreased，and mitochondrial membrane density increased.Compared with the control group，the relative activities of GSH/GSSG，NADPH/NADP ＋，SOD，GPX4，and the levels of Bcl.2，p.AKT/AKT，p.AMPK/AMPK and Nrf2 in OGD/R group decreased（ P ＜0.05），Fe  2＋ content，intracellular ROS levels，lipid ROS levels，4.HNE，MDA levels，LDH release，Bax，and cleaved Caspase.3 levels increased（ P ＜0.05）.After treatment with loganin，the mitochondrial ridge in neuronal mitochondria became more complete and the fragmentation disappeared.The relative activity of GSH/GSSG，NADPH/NADP ＋，SOD，GPX4，Bcl.2 level，p.AKT/AKT，p.AMPK/AMPK，and Nrf2 in OGD/R＋L.loganin group，OGD/R＋M.loganin group and OGD/R＋H.loganin group were higher than those in OGD/R group，Fe  2＋ content，intracellular ROS levels，lipid ROS levels，4.HNE，MDA levels，LDH release，Bax，and cleaved Caspase.3 levels were lower than those in OGD/R group（ P ＜0.05）.With the increase of the dose of loganin，the improvement effects were more significant.The above indexes of OGD/R＋H.loganin＋ML385 group were consistent with the trend of OGD/R group.  Conclusion： loganin may ameliorate OGD/R.induced neuronal ferroptosis by regulating the AKT/AMPK/Nrf2 pathway.

Keywords  oxyglucose deprivation/reoxygenation; ferroptosis; loganin; protein kinase B/adenylate.activated protein kinase/nuclear factor.E2.related factor 2 pathway; neurons

脑梗死是一种常见的缺血性脑血管病，是由于各种原因造成脑动脉闭塞，引起相应供血区域脑细胞缺血、缺氧、坏死，出现相应功能障碍；临床上通常通过恢复血流来治疗，但恢复血流可能导致缺血区域的继发性损伤，简称为缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）  ［1］ 。IRI会诱发线粒体氧化代谢受损及神经元能量消耗，进而导致细胞程序性死亡  ［2］ 。铁死亡是一种铁依赖的细胞死亡形式，由脂质过氧化物的过量积累介导，其对脑梗死等多种神经系统疾病具有重要意义  ［3］ 。寻找适当的药物来保护神经元免受IRI的影响是目前急需解决的难题之一。

马钱苷（loganin，log）是一种从山茱萸中提取的环烯醚萜苷，具有神经保护  ［4］ 、抗氧化  ［5］ 、抗炎  ［6］ 等特性。有研究发现，马钱苷可减轻脂多糖刺激的BV2小胶质细胞对原代神经元的损伤，对大脑中动脉闭塞小鼠发挥抗炎和神经保护作用  ［7］ 。据报道，调节腺苷酸活化蛋白激酶（AMP.activated protein kinase，AMPK）/核因子.E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2.related factor 2，Nrf2）信号通路可以对IRI中的神经元起到保护作用  ［8］ 。蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）参与细胞生长、增殖、凋亡和蛋白质合成等生物过程  ［9］ 。AKT也与Nrf2介导的抗氧化反应有关  ［10］ 。研究发现，激活AMPK/Nrf2信号通路可减轻氧葡萄糖剥夺/复 氧（oxygen.glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R） 诱导的神经元损伤  ［11］ 。本研究探讨马钱苷通过激活AKT/AMPK/Nrf2通路减轻OGD/R诱导的神经元铁死亡的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

3只妊娠C57BL/6j小鼠购自广东省医学实验动物 中心［许可证号SCXK（粤）2022.0002］；饲养于昼夜12 h 交替、湿度45%、室温（23±1）℃环境中，自由进食。马钱苷（货号：YT62708）购自北京伊塔生物科技有限公司；ML385（货号：S86700）购自上海源叶生物科技有 限公司；4.羟基壬烯醛（4.hydroxynonenal，4.HNE） 试剂盒（货号：EK.M25633）、超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）试剂盒（货号：EK.M29371）、  丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒（货号：EK.M29370） 购自上海酶研生物科技有限公司；还原型谷胱甘肽（GSH）/氧化型谷胱甘肽（GSSG）（货号：AAT.10056）和还原型辅酶Ⅱ（nicotinamide adenine nucleoside phosphorylase b，NADPH）/辅脱氢酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP ＋）试剂盒（货号：K347.100）购自上海研卉生物科技有限公司；谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）（货号：ybC994Hu）试剂盒购自上海钰博生物科技有限公司；四唑盐（MTT）试剂盒（货号：FT.P9S1344X）购自上海梵态生物科技有限公司；总活性氧（reactive  oxygen species，ROS）荧光探针CM.H2DCFDA（货号：HY.D1713）及脂质ROS荧光探针C11.BODIPY581/591 （货号：HY.D1301）购自美国MCE公司；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒（货号：Dojindo） 购自上海觅拓生物科技有限公司；磷酸化的蛋白激酶B （p.AKT）抗体（货号：4060）、AKT（货号：9272）、磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶（p.AMPK）抗体（货号：4185）购自Cell Signaling Technology公司；铁含量检测试剂 盒（货号：ab83366）、B细胞淋巴瘤2（B.cell lymphoma 2， Bcl.2）（货号：ab32124）、Bcl相关X蛋白（Bcl.associated X protein，Bax）抗体（货号：ab32503）、剪切的半胱天冬氨酸蛋白酶3（cleaved Caspase.3）抗体（货号：ab2302）、AMPK抗体（货号：ab3760）购自Abcam公司；Nrf2抗体（货号：bs.2013）购自RBioss公司；电泳仪（货号：1645050.OG）购自北京智杰方远科技有限公司；离心机（货号：D1524R）购自大龙兴创实验仪器（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原代皮层神经元的培养

参考文献［12］将妊娠的C57BL/6j小鼠处死，从胎鼠中分离原代皮质神经元。首先分离小鼠大脑皮层，大脑皮层经胰酶消化后，分离神经元置于含有2%  B27和2 mmol/L谷氨酰胺的神经基础培养基中，在37 ℃、5%CO 2 的条件下培养10 d后开始进行实验。

1.2.2 OGD/R模型的构建及分组

将原代神经元用不含葡萄糖的杜尔伯科改良伊格尔（DMEM）培养基培养，然后将培养基置于1%O 2、5%CO 2和94%N 2的缺氧37 ℃培养箱培养2 h，诱导OGD损伤。在OGD之后，将培养基更换为新鲜的基础培养基，然后将培养基置于37 ℃、5%CO 2培养箱培养24 h构建OGD/R模型  ［13］ 。

将神经元分为对照组、OGD/R组、OGD/R＋L.马钱苷组、OGD/R＋M.马钱苷组、OGD/R＋H.马钱苷组、OGD/R＋H.马钱苷＋ML385组。对照组神经元未做任何处理，OGD/R＋L.马钱苷组、OGD/R＋M.马钱苷组、OGD/R＋H.马钱苷组分别 用10、30、50 μmol/L马钱苷预处理1 h  ［14］ ，然后暴露于  OGD/R；OGD/R＋H.马钱苷＋ML385组用马钱苷 （50 μmol/L）加ML385（1 μmol/L）预处理1 h后暴露于OGD/R  ［12］ 。

1.2.3 观察神经元线粒体形态

收集各组神经元，用2%戊二醛固定2 h，然后用1%四氧化锇固定1 h，经过乙醇脱水，包埋剂包埋后，用乙酸双氧铀和柠檬酸铅进行染色，在透射电子显微镜下观察神经元线粒体形态。

1.2.4 比色法检测细胞内铁含量

按照铁含量检测试剂盒检测神经元内铁浓度。Fe  2＋ 相对含量＝［Fe  2＋ （实验组）－Fe  2＋ （空白组）］/［Fe  2＋ （对照组）－Fe  2＋ （空白组）］×100%。

1.2.5 比色法检测神经元细胞的GPX4、4.HNE、SOD、MDA、GSH/GSSG、NADPH/NADP ＋、LDH水平

用裂解缓冲液裂解神经元细胞，采用GPX4、 4.HNE、SOD、MDA、GSH/GSSG、NADPH/NADP ＋、LDH试剂盒检测神经元细胞的GPX4、4.HNE、SOD、MDA、GSH/GSSG、NADPH/NADP ＋、LDH水平。

1.2.6 CM.H2DCFDA及C11.BODIPY581/591检测ROS水平

使用CM.H2DCFDA检测细胞内ROS水平。在各组神经元中加入10 μmol/L CM.H2DCFDA 37 ℃避光孵育30 min，在酶标仪中检测荧光强度。使用C11.BODIPY581/591测量脂质ROS水平。在各组神经元中加入2.5  μmol/L C11.BODIPY581/591并在37 ℃避光孵育30 min，用酶标仪检测荧光强度。

1.2.7 MTT检测细胞活性

药物处理结束后收集各组细胞，弃去培养基，然后加入0.5 mg/mL MTT试剂37 ℃孵育4 h，弃去MTT溶液后，加入100 μL 二甲基亚砜（DMSO）溶解甲瓒，最后上机检测吸光度。

1.2.8 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测凋亡相关蛋白以及通路相关蛋白表达

收集经裂解液处理的各组神经元细胞，提取各组神经元的总蛋白，电泳分离后转到聚偏二氟乙烯 （PVDF）膜上，之后用脱脂牛奶封闭，加入一抗Bcl.2  （1∶2 000）、Bax（1∶2 000）、cleaved Caspase.3（1∶2 000）、 AKT（1∶1 000）、 p.AKT（1∶1 000）、AMPK（1∶1 000）、 p.AMPK（1∶2 000）、Nrf2（1∶2 000）和GAPDH抗体（1∶1 000），在4 ℃下过夜，加入二抗，加入显色剂使目的条带显色，使用Image Lab  TM 软件分析目标蛋白的灰度值。

1.3 统计学处理

采用Graphpad Prism 8.0软件进行数据分析。符合正态分布的定量资料以均数±标准差（ x  ± s ）表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），两组间比较采用SNK. q 检验。 P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1  马钱苷对OGD/R诱导的神经元线粒体形态的影响

对照组线粒体形态结构正常，无异常现象；OGD/R组神经元线粒体出现碎片现象，嵴减少，线粒体膜密度有所增加；马钱苷处理后神经元线粒体中的线粒体嵴 变得较为完整，碎片化现象消失；OGD/R＋H.马钱 苷＋ML385组现象与OGD/R组现象相似。详见图1。

2.2 马钱苷对OGD/R诱导的神经元铁含量的影响

与对照组比较，OGD/R组Fe  2＋ 相对含量提高 （ P ＜0.05）；与OGD/R组比较，OGD/R＋L.马钱苷组、OGD/R＋M.马钱苷组、OGD/R＋H.马钱苷组Fe  2＋ 相对含量下降（ P ＜0.05），且随着马钱苷剂量的增加， Fe  2＋ 相对含量变化更明显，呈现剂量相关性；与OGD/R＋ H.马钱苷组比较，OGD/R＋H.马钱苷＋ML385组Fe  2＋ 相对含量升高（ P ＜0.05）。详见表1。

2.3  马钱苷对OGD/R诱导的神经元抗氧化指标的影响

与对照组比较，OGD/R组GSH/GSSG、NADPH/NADP ＋、SOD、GPX4相对活性下调（ P ＜0.05）；与OGD/R组比较，OGD/R＋L.马钱苷组、OGD/R＋M.马钱苷组、OGD/R＋H.马钱苷组GSH/GSSG、NADPH/NADP ＋、SOD、GPX4相对活性上调（ P ＜0.05）；与OGD/R＋H.马钱苷组比较，OGD/R＋H.马钱苷＋ML385组GSH/GSSG、NADPH/NADP ＋、SOD、GPX4相对活性下调（ P ＜0.05）。详见表2。

2.4  马钱苷对OGD/R诱导的神经元脂质过氧化的影响

OGD/R组较对照组细胞内ROS水平、脂质ROS 水平以及4.HNE、MDA水平上升（ P ＜0.05）；与OGD/R 组比较，OGD/R＋L.马钱苷组、OGD/R＋M.马钱苷组、OGD/R＋H.马钱苷组细胞内ROS水平、脂质ROS 水平以及4.HNE、MDA水平下降（ P ＜0.05）；OGD/R＋ H.马钱苷＋ML385组较OGD/R＋H.马钱苷组细胞内ROS水平、脂质ROS水平以及4.HNE、MDA水平上升（ P ＜0.05）。详见表3。

2.5 马钱苷对OGD/R诱导的神经元细胞活力和细胞死亡的影响

OGD/R组较对照组细胞活力以及Bcl.2水平显著降低，LDH释放量、Bax以及cleaved Caspase.3水平升高（ P ＜0.05）；与OGD/R组比较，OGD/R＋L.马钱苷组、OGD/R＋M.马钱苷组、OGD/R＋H.马钱苷组细胞活力以及Bcl.2水平升高，LDH释放量、Bax以及 cleaved  Caspase.3水平降低（ P ＜0.05）；OGD/R＋ H.马钱苷＋ML385组较OGD/R＋H.马钱苷组细胞活力以及Bcl.2水平下降，LDH释放量、Bax以及cleaved Caspase.3水平上升（ P ＜0.05）。详见图2、表4。

2.6 马钱苷对OGD/R诱导的神经元中AKT/AMPK/Nrf2通路蛋白表达的影响

OGD/R组较对照组p.AKT/AKT、p.AMPK/AMPK、 Nrf2下降（ P ＜0.05）；与OGD/R组比较，OGD/R＋ L.马钱苷组、OGD/R＋M.马钱苷组、OGD/R＋H.马钱 苷组p.AKT/AKT、p.AMPK/AMPK、Nrf2升高（ P ＜0.05）； OGD/R＋H.马钱苷＋ML385组较OGD/R＋H.马钱苷组p.AKT/AKT、p.AMPK/AMPK、Nrf2下降（ P ＜0.05）。详见图3、表5。

3 讨 论

据统计，脑卒中每年导致全球数百万人脑损伤，尽管已知缺血会导致细胞损伤，但其潜在机制尚未明确，且目前还没有确切的治疗方法可以减少梗死面积或神经功能障碍  ［15.16］ 。研究发现，马钱苷可能是治疗缺血性脑卒中的潜在神经保护剂  ［17.18］ 。铁死亡与脑卒中的发病机制密切相关  ［19］ 。在本研究中，OGD/R处理后神经元线粒体出现碎片现象，嵴减少，线粒体膜密度有所增加（铁死亡的主要特征），且神经元的细胞活力降低，细胞死亡增加，表明OGD/R促进了神经元损伤。马钱苷处理后神经元线粒体中的线粒体嵴变得较为完整，碎片化现象消失，神经元的细胞活力增加，细胞死亡降低，提示马钱苷可能对OGD/R神经元损伤起到了改善作用。

铁死亡是一种细胞死亡形式，其特征在于脂质过氧化的铁依赖性积累  ［20］ 。4.HNE是脂质过氧化的最终产物，已被确定为参与调节细胞增殖、铁死亡和细胞凋亡的关键第二信使  ［21］ 。脂质ROS的积累是铁死亡的一个重要指标  ［22］ 。而GPX4是一种抗氧化防御酶，有研究发现，GXP4的消融会诱导铁死亡并引发前脑神经元的神经变性  ［23］ 。GPX4可使用GSH作为共底物减少脂质氢过氧化物，抑制铁死亡  ［24］ 。而NADPH可以诱导GSSG转化为GSH  ［25］ 。NADPH和GSH的还原形式以及SOD是最重要的内源性抗氧化剂  ［26］ 。 因此，本研究检测以上指标观察马钱苷是否对铁死亡 产生影响。结果发现，OGD/R处理后神经元中GSH/GSSG、 NADPH/NADP ＋、SOD、GPX4水平均下降，Fe  2＋ 含量、神经元中的细胞内和脂质ROS以及4.HNE、MDA水平增加，提示OGD/R可能降低了神经元的抗氧化能 力，诱导了铁死亡。而马钱苷处理后神经元中 GSH/GSSG、NADPH/NADP ＋、SOD、GPX4水平均升 高，Fe  2＋ 含量、神经元中的细胞内和脂质ROS以及 4.HNE、MDA水平降低，证实马钱苷有抗氧化作用，可减轻铁死亡。

AKT和AMPK的磷酸化诱导Nrf2通路的活化，已有大量研究表明激活AKT/AMPK/Nrf2通路可以减轻炎症和氧化应激损伤  ［11］ ，研究发现，激活AMPK/Nrf2信号通路可能减轻IRI，发挥神经保护作用  ［9］ 。本研究 结果发现，OGD/R处理后神经元中p.AKT/AKT、 p.AMPK/AMPK、Nrf2水平均下降，而马钱苷使p.AKT/AKT、p.AMPK/AMPK、Nrf2升高，提示马钱苷可能通过激活AKT/AMPK/Nrf2信号通路改善OGD/R诱导的神经元铁死亡。为了进一步验证马钱苷的作用机制，本研究在使用马钱苷处理的基础上，加入AKT/AMPK/Nrf2通路抑制剂ML385，结果发现，ML385可减弱马钱苷对OGD/R诱导的神经元铁死亡的抑制作用，表明 马钱苷可能通过激活AKT/AMPK/Nrf2通路改善OGD/R 诱导的神经元铁死亡。

综上所述，马钱苷可能通过激活AKT/AMPK/Nrf2通路改善OGD/R诱导的神经元铁死亡。然而，马钱苷是否可以通过调节其他通路改善OGD/R诱导的铁死亡，需要进一步深入探究。

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（收稿日期：2022.10.10）

（本文编辑 邹丽）