黄芪多糖作为疫苗佐剂的免疫活性研究进展

沈冠男 宛传奇 杨 扬 吴肖苇 何煜舟

接种疫苗是预防和控制传染病传播的最有效策略，但单一抗原成分的疫苗引出的免疫反应无法给机体提供有效的免疫保护，因此需要在疫苗中添加佐剂以提升人体免疫效果[1]。佐剂是增强和调节疫苗抗原免疫反应的免疫刺激物，与抗原共同注射机体后，可延长机体对抗原的免疫时间，增强单核吞噬细胞系统的吞噬呈递作用以及刺激淋巴细胞的增殖分化，以提高疫苗的有效性[2]。铝佐剂是最早被发现的佐剂，自1932 年首次应用于人体以来，在传染病的预防中发挥了重大作用，研究表明氢氧化铝一般只诱导Th2 型免疫反应，近年来也有研究称铝佐剂可诱导Th1 型免疫反应但是受接种途径的影响[3]。之后发现的油乳剂虽然可以同时诱导Th1 和Th2 型免疫反应但同时存在发烧、头痛、恶心、炎症等不良反应[4]。近年来中药多糖的免疫学活性被发掘，其中黄芪多糖（astragalus polysaccharides，APS）是备受关注的一种多糖，诸多学者证实APS 可被用作疫苗佐剂。本文基于这些研究对于APS 作为一种疫苗佐剂的免疫活性研究进展作以下综述。

1 中药多糖佐剂分子机制

从中药植物提取的多糖，具有生物相容性、可降解性和安全的免疫调节作用[5]。研究表明，从黄芪、枸杞、板蓝根、茯苓和肉苁蓉中提取的多糖成分可以作为佐剂应用在疫苗中刺激免疫应答[6]。中药植物多糖疫苗佐剂分子机制主要包括以下几个方面[7]：（1）激活巨噬细胞吞噬与呈递功能；（2）促进树突状细胞的成熟与分化；（3）促进淋巴细胞的增殖和活化；（4）降低Tregs 细胞对效应T 细胞增殖的抑制作用。但由于中药来源广泛，提取工艺不同，不同来源的多糖结构存在较大差异，这种差异对多糖的免疫活性产生的影响未知[8]。

2 APS 的构成

黄芪首载于《神农本草经》，被列为上品，具有“补气圣药”的美称，来源为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 或 膜 荚 黄 芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根。黄芪中提取的主要化学成分——APS 是近年来研究的热点，具有调节免疫、抗肿瘤、降血糖、抗衰老和抗炎等药理作用[9-10]。APS 的有效成分主要由多种单糖和葡聚糖（glucan，Glu）构成。根据已有研究，APS 含有的单糖组分包括葡萄糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、半乳糖、半乳糖醛酸、甘露糖、岩藻糖及来苏糖。Glu 是基于吡喃葡萄糖基的多糖，根据其单糖残基结构，可以是α-D-Glu、β-D-Glu 或α，β-D-Glu[11]。APS 的分子量分布较广，大致可分为4 段，＞1000 kDa、100～1000 kDa、10～100 kDa 和＜10 kDa[12]。受不同提取方式的影响，APS 的性质与生物学活性也有很大差别。以往研究表明糖苷键和单糖的链接方式对多糖生物活性的影响大于单糖的组成，分支度过大或过小都无法使多糖生物活性达到理想状态。Jiang 等[13]先采用沸水浸提APS，之后分别采用不同浓度的乙醇分级醇沉（20%、40%、60%、80%）得到4 种APS，对这4 种APS的分子量采用高效凝胶渗透色谱法联合示差折光检测器测定，得到结果分别为257.7、40.1、15.3 和3.2 kDa。其中，APS1 只含有葡萄糖，APS2 只含有阿拉伯糖，APS3 含有鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，摩尔比为1∶10.76∶6.55∶12，APS4 含有半乳糖和阿拉伯糖，摩尔比为3.02∶1。将这四种多糖进行生物活性研究，发现只有APS2 和APS3 具有免疫学活性，可刺激淋巴细胞增殖，这说明不同的化学结构对APS 生物活性存在影响。李宏全等[14]使用微波辅助提取技术提取得到APS，进一步分离纯化后利用柱前衍生化HPLC 法测试APS 的单糖组成。结果显示APS 由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖构成，其物质的量比为1.19∶72.01∶5.85∶20.95，相对分子质量为1.1×104，葡萄糖以α-型糖苷键连接成其主链，并含有少量β-糖苷键。该团队前期研究发现APS 作为疫苗佐剂可提高鸡新城疫和传染性腔上囊病疫苗免疫力和免疫器官增重[15]，但并未证实不同糖苷键对APS 的免疫学活性存在影响。

3 APS 的免疫调节作用

3.1 对巨噬细胞的影响 当巨噬细胞受到抗原刺激后极化成M1 型巨噬细胞和M2 型巨噬细胞，前者能够分泌相应的促炎性细胞因子，在炎症发生的早期具有重要意义，后者在炎症消退、组织改造、功能修复等方面起到重要作用；识别并消灭病原体、清除衰亡细胞、维持机体内环境稳态是巨噬细胞吞噬功能的主要表现形式[16]。巨噬细胞处理外源性抗原和内源性抗原后，具有免疫原性的小分子肽段与主要组织相容性复合体（major histocompatiblity complex，MHC）结合形成肽-MHC 复合物并表达于细胞表面，T 细胞识别这些肽-MHC 复合物后被激活。罗晶晶等[17]发现巨噬细胞的活化和吞噬功能以及巨噬细胞表面细胞活化标志分子的水平受APS 影响。在加入了不同浓度的APS（0.1、1、10、50 和100 μg/mL，对照组为0 μg/mL）培养基中，使用100 μg/mL 的APS 处理过的巨噬细胞表面CD80、CD86、MHC-Ⅱ分子的表达水平、细胞吞噬率及单个细胞吞噬能力最高。在免疫抑制状态下，APS 依旧可以刺激巨噬细胞活化，且与剂量呈正相关。史晶晶等[18]建立了环磷酰胺所致免疫抑制模型小鼠，给予不同剂量的APS（0.02、50、100、200 mg/kg），小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数随APS 剂量增加而增加，在给予200 mg/kg APS 时作用最强。Bamodu 等[19]发现，用APS 与人单核细胞衍生巨噬细胞（human monocyte-derived macrophage，MDM）共培养的非小细胞肺癌细胞培养基中，暴露于16 mg/mL APS 的培养基培养48 h 后极化成M1 型巨噬细胞的MDM 从处理前的1.59%上升到78.1%，相反的是M2 极化呈下调趋势。该团队称此实验首次证明了APS 对巨噬细胞M1 极化有优先调节作用。Zhu 等[20]发现APS（10～80 μg/mL）通过增加MHC-Ⅱ、CD40、CD80 和CD86 的 表 达 促 进RAW264.7 巨噬细胞的成熟。

3.2 对树突状细胞（DC）的影响 DC 是机体免疫反应的始动者，是机体最强的抗原提呈细胞。DC 根据存在状态分可分为成熟状态和未成熟状态，未成熟DC 具有免疫监视、检测潜在抗原等重要作用，成熟DC 具有启动和调节免疫应答作用，当受到抗原刺激后，它们捕捉并加工抗原，以MHC-多肽复合物的形式呈现于细胞表面，通过MHC-多肽复合物激活T 细胞与B 细胞[21-22]。An 等[23]研究发现，APS 可以刺激人外周血DC 活化，增加DC 表面MHC-Ⅱ、CD86和CD9 等各种免疫相关抑制因子的表达，从而增强DC 与T 细胞之间的相互作用。另一项研究[24]发现，APS 处理的浆细胞DC（pDC）在缓解期比未经处理的慢性粒细胞白血病（CML）组分泌更多的干扰素-α（IFN-α）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α），这表明APS 可以促进pDC 在CML 中的功能,并促进pDC 向DC 转化。Hwang 等[25]研究了鼻内给予APS 对注射了B16 黑色素瘤细胞（0.5×106/100 μL）的小鼠黏膜免疫细胞活化的影响，发现APS 的鼻内治疗刺激了小鼠肠系膜淋巴结（mesenteric lymph nodes，mLN）中DC 增长，其作用机制为上调CC-趋化因子受体7 的表达来发挥作用。此外，鼻内治疗APS 激活了DC，这进一步刺激了mLN中的自然杀伤细胞和T 细胞。这些发现表明，APS可作为局部黏膜佐剂，增强免疫检查点抑制剂的抗癌作用。

3.3 对T/B 淋巴细胞的影响 T 淋巴细胞和B 淋巴细胞是人体最为重要的免疫细胞，两者相互协作，具有免疫识别功能。T 淋巴细胞诱导细胞免疫，分化成熟后识别并直接杀死靶细胞。Th1 细胞和Th2 细胞是辅助性T 细胞的两种亚型，是机体重要的免疫调节细胞，Th1 细胞特征在于分泌干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α），Th2 细胞特征在于分泌白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-5（IL-5）、白细胞介素-10（IL-10）和白细胞介素-13（IL-13）。CD3+T 细胞代表总T 细胞水平，根据细胞表面标志物不同，T淋巴细胞又分为CD4+T 和CD8+T 淋巴细胞两个主要亚群，CD4+T 淋巴细胞可提高免疫功能，而CD8+T 淋巴细胞则相反[26]。刘艳玲等[27]使用APS 高、中、低剂量（400、200、100 mg/kg）给予肺癌模型小鼠，发现小鼠脾组织白细胞介素-2（IL-2）和IFN-γ 含量显著升高，IL-4 和IL-10 含量显著降低，且呈剂量依赖性。此外APS 可显著提高肺癌小鼠免疫功能，主要表现在APS 剂量依赖性提高小鼠胸腺指数、脾指数，CD3+T 细胞、CD4+T 细胞、CD8+T 细胞水平和CD4+/CD8+比值。Jin 等[28]研究发现，APS 硫酸化淫羊藿多糖（APSsulfated epimedium polysaccharide，APS-sEPS）对新生仔猪外周血淋巴细胞和肠黏膜具有免疫作用，可增强外周血和空肠黏膜中IFN-γ、IL-4、IL-10、分泌型免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）的浓度，并刺激仔猪T 淋巴细胞增殖。

B 淋巴细胞诱导体液免疫，基本功能是产生抗体、呈递抗原和分泌细胞因子。参与体液免疫应答过程的Ig 主要有3 种, 即IgA、IgG 和IgM，因此检测Ig 浓度是监测体液免疫功能强弱的重要指标之一。舒迎霜等[29]发现APS 可提高比格犬血清IgA、IgG、IgM 和IFN-γ 水平，能增强体液免疫应答。研究[30-32]发现APS 可以提高环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠的免疫力，促进T 淋巴细胞和B 淋巴细胞的增殖，刺激IgA、IgG、IgM、IL-6、IFN-γ、补体C3、补体C4、TNF-α 产生，刺激淋巴细胞转化及提高免疫器官指标。

3.4 对调节性T 细胞（Terg）的影响 Treg 细胞是一类控制体内自身免疫反应性的T 细胞亚群，能够抑制其他细胞的免疫应答。Du 等[33]研究表明，APS 通过抑制Treg 细胞活性来增强小鼠乙型肝炎病毒（HBV）疫苗的免疫反应，高效刺激细胞毒性淋巴细胞的活性。Li 等[34]研究表明，APS 可通过上调IFNγ，下调IL-4 和IL-10 的表达，抑制FOXp3 mRNA的表达，降低Treg 细胞在肿瘤微环境下的免疫抑制作用。

4 APS 作为疫苗佐剂的免疫调节作用

APS 作为疫苗佐剂在动物模型中起到明显的免疫增强效果，研究涉及新城疫病毒、乙型肝炎病毒、手足口病、流感等多种疫苗。Xue 等[35]在新城疫病毒疫苗动物模型研究中发现，新城疫疫苗联合APS 可促进淋巴细胞增殖，显著提高血清抗NDV 抗体滴度和IFN-γ、IL-2、IL-4 和IL-6 浓度，提高外周血中CD4+和CD8+T 细胞浓度。总体结果表明，鸡用新城疫活疫苗联合APS 可以刺激新孵雏鸡体液和细胞反应增强。Du 等[33]研究了APS 作为乙型肝炎病毒疫苗佐剂对小鼠免疫系统的影响，发现APS 可增强乙型肝炎病毒疫苗对小鼠体液免疫和细胞免疫应答，通过增加MHC-Ⅰ/Ⅱ和共刺激分子（CD40、CD80 和CD86）的表达，从而促进树突状细胞成熟。Li 等[36]研究发现手足口病疫苗联合APS 能上调INF-γ 和IL-6 基因表达，并上调特异性抗体滴度，这表明APS 可用作手足口病疫苗的免疫调节剂提供更好的抗手足口病病毒保护。有研究[37]发现，APS作为甲型流感（H3N2）疫苗佐剂可通过诱导Th1/Th2 平衡和IL-17 和IgG1 抗体的产生增强瑞士白化病小鼠的免疫应答。Abdullahi 等[38]联合使用APS和H5N1 流感疫苗，实验结果表明APS 组雏鸡血清中IL-2、IL-10、TNF-α 和IFN-β 的表达增强，说明APS 能刺激细胞因子产生和巨噬细胞活化，联合使用APS 可能对鸡致命的H5N1 流感病毒感染有更好的保护作用。

5 小 结

APS 提取自天然植物黄芪，具有毒性低、安全性好的优点，然而受到不同提取手段影响，APS 分子结构、分子量、单糖组成及糖链连接上均有差异。近年来大量研究发现APS 对免疫系统具有强大的调节作用，是一种很有开发潜力的新型疫苗佐剂。但目前APS 作为疫苗佐剂大多应用于动物疫苗，用于人类疫苗的研究存在空白，今后开发人用APS 疫苗佐剂仍需作进一步深入探讨。此外APS 作为多组分物质，提纯和结构研究限制了其作为临床疫苗佐剂的发展[39]。因此今后研究的重点与难点在于阐明APS 的高级结构并分析寡糖片段及相对应的生物活性，进一步探讨糖结构作用的有效靶点及其机制。